[發明專利]一種基于液體活檢的肝癌檢測的試劑盒

有效

• 申請號: 201710168576.2
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106932579B
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 段彪;陳昌岳;張培培;張祥林;馮麗娜;蔡紅東
• 申請（專利權）人: 上海美吉逾華生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種基于液體活檢的肝癌檢測的試劑盒，包括：用于增強染色效果的染色增強液和帶熒光染色標記的特異性抗體；其中所述特異性抗體包括：ASGPR1抗體、CD45抗體和CPS1抗體；所述染色增強液包括濃度為0.001～1mg/mL的表面活性劑。本發明的試劑盒可以有效的富集目標細胞，并且確認富集的目標細胞是否來源于肝癌的早期患者。同時，本發明通過雙瘤標檢測增加腫瘤檢測靈敏度并且進一步通過CEP8的檢測保證檢測的準確性。此外，本發明通過染色增強液加強染色效果，使多種帶熒光染色標記的抗體都可以與目標細胞結合，對目標細胞染色，染色效果更好，熒光更強，而且邊界清晰。

技術領域

本發明涉及液體活檢領域，具體地說是一種基于液體活檢的肝癌檢測的試劑盒。

背景技術

肝癌作為一種常見的癌癥，與其它癌癥相比，其在全世界范圍內發病率位居第五，而死亡率位居第三。在我國，肝癌的發病率和死亡率均要高于世界水平。據統計，每年平均每十萬人口就有近30人被診斷為肝癌患者，而每年平均每十萬人口中就有26人死于肝癌，僅低于排在首位的肺癌死亡人數。因而，對于肝癌的早期篩查以及疾病發展過程中的檢測就顯得尤為重要。在這一方面，基于循環腫瘤細胞(CTC)檢測的方法具有眾多傳統檢測方法所沒有的優勢，包括無創、快捷和適用于早期篩查等。

CTC是指自發或因診療操作由實體瘤原發灶或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞。由于轉移是癌癥相關死亡的主要原因，而CTC作為轉移的種子，在新的腫瘤生物標志物的發現、腫瘤預后判斷及個體化治療方面存在很大的應用潛力，是國內外腫瘤研究的熱點之一。據統計，40％的肝癌患者在治療后一年內就會復發，研究指出血液中CTC的陽性率與肝癌的預后復發和低的生存期相關。所以，較高的死亡率和復發風險就更加突出了CTC早期檢測的重要性。

到目前為止，對于肝癌CTC的檢測主要依賴于EpCAM的CTC捕獲、富集分析平臺，基于此CTC陽性檢出率可以達到約40％。雖然基于EpCAM的CTC捕獲富集仍然被作為肝癌中CTC檢測的金標準，但有以EpCAM為生物標志物對于發生EMT的CTC的檢測仍存在很高的假陰性。此外，EpCAM這一廣譜的上皮生物標志物不僅不適合用于腫瘤早期的檢測，而且也不具有組織特異性，無法追溯CTC的具體組織來源，而這一點對于后續的腫瘤治療具有重要意義。因此，發現并應用一些CTC組織特異性的生物標志物進行CTC的早期篩查及檢測分析顯得尤為重要。

據已有研究顯示，有包括EpCAM、CK家族蛋白、MUC1等眾多生物標志物被用于肝癌CTC的檢測分析，其中以脫唾液酸糖蛋白受體1(ASGPR1)和氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)作為標志物不僅具有較高的CTC陽性檢出率，而且還具有很高的肝組織特異性。有研究基于ASGPR1-磁珠用于肝癌CTC的捕獲，結果顯示高于80％的肝癌患者中存在ASGPR1+的CTC，聯合CPS1后，其CTC陽性檢測率可以達到91％。而針對于CPS1，聯合CK的CTC陽性檢出率為89％，而且其在肝組織中也具有較高的特異性。

據此，聯合ASGPR1和CPS1作為肝癌CTC早期篩查的生物標志物，不僅可以將檢測的靈敏度最大化，而且還可以據此判定早期篩查樣品中CTC的具體組織來源。

公告日為2014年1月15日，公告號為CN102313813B的中國專利中公開了一種通過免疫熒光染色對稀有細胞進行檢測的方法，該方法對白細胞、稀有細胞和細胞核進行三色染色，再通過熒光檢測。但是該方法僅能通過一種單抗來特異性識別該稀有細胞，容易造成漏檢。同時，由于細胞的異質性，每個細胞表達的抗原(抗體)量不一，導致有時熒光強度非常微弱，在熒光顯微鏡下難以分辨。

發明內容

本發明的主要目的是針對現有技術存在的不足提供一種基于液體活檢的肝癌檢測的試劑盒，利用該試劑盒可以檢測外周血中CTC的數量，判斷該CTC是否來源于肝癌，區分檢出的早期肝癌CTC的類型，而且檢測結果準確，誤差小。

在本發明的一方面，本發明是通過如下技術方案實現的：