[發明專利]外泌體的分離方法在審

申請號：	201710167823.7	申請日：	2017-03-21
公開（公告）號：	CN106967747A	公開（公告）日：	2017-07-21
發明（設計）人：	陳意雄;朱鵬飛;蔡曉龍;鄒杰	申請（專利權）人：	上?？凭S創生物科技有限公司;漢恒生物科技（上海）有限公司
主分類號：	C12N15/85	分類號：	C12N15/85;C12N5/10;C12N5/071
代理公司：	常州市權航專利代理有限公司32280	代理人：	黃晶晶
地址：	200120 上海市浦東新區自由貿易試***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	外泌體分離方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種外泌體的分離方法，屬于生物技術領域。

背景技術

外泌體(exosome)是由細胞內多泡體(multivesicular body，MVB)與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的一種直徑約30～120nm的膜性囊泡。最早由Johnstone等研究者在研究網織紅細胞向成熟紅細胞轉變過程時發現。又經過多年研究，科學家發現除了網織紅細胞以外，T細胞、B細胞、血小板、樹突細胞、肥大細胞等血細胞及上皮細胞、腫瘤細胞等其他非血源性細胞都會分泌外泌體，被分泌出的外泌體會進入血液、唾液、尿液、及乳汁等體液中，通過循環系統到達其他細胞與組織，產生遠程調控作用。

外泌體中包含多種RNA分子，包括mRNA、miRNA等。但也有少數報道指出，某些特殊來源的外泌體也會包含DNA分子，例如，有研究者發現惡性膠質瘤及星形細胞瘤細胞所釋放的外泌體中可能含有線粒體DNA。自2007年首次在外泌體中發現mRNA和miRNA，研究者已在人類及小鼠外泌體中發現了數千個不同mRNA，而且有些轉錄本只存在于外泌體中，在胞內卻無法檢測到。這表明，RNA進入外泌體的過程會受到某些特殊的分選機制控制。目前，外泌體RNA分子收錄最全的數據庫共收錄2375個外泌體mRNA和764個miRNA，但是這也僅僅是能夠檢測到的所有外泌體RNA的一部分，仍舊有大量外泌體RNA的功能未知。

最常見的外泌體蛋白組成包括膜轉運和融合相關蛋白(Rab GTPases、Annexins、Flotillin等)、多囊泡胞內體產生相關蛋白(Alix、TSG101等)、熱休克蛋白家族(HSP70，HSP90)、整合素和四跨膜蛋白超家族(CD63、CD9、CD81、CD82等)，這些成分反映了其生物起源。蛋白質，如CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix和HSP70常見于大多數外泌體中。

目前，針對外泌體相關的功能學研究越來越多，但是從細胞中分離得到的外泌體時，回收率很低，需要收集大量細胞培養上清，以滿足實驗需求。另外，目前公認超離法是最常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。但過程比較費時，且重復離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質量。此外，在研究特定細胞分泌的外泌體對其他細胞的功能研究時，通常在感染一段時間后，采用Western blot來驗證，不能實時監測。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種外泌體分離方法，用于解決現有技術的不足。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種外泌體的分離方法，所述分離方法至少包括以下步驟：

(1)向目標細胞中導入帶有標簽的CD63，使用細胞培養基進行培養；

所述標簽是指可以起到標記蛋白質的物質，可以采用現有技術中的作為標簽的物質以及方法。

優選地，所述標簽選自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一種或幾種。

優選地，所述CD63通過載體攜帶導入目標細胞；所述載體是指pcDNA3.1。

優選地，向目標細胞中導入帶有標簽的CD63后培養12～36h后篩選出含有CD63的陽性克隆細胞，再繼續培養陽性克隆細胞。所述篩選的方法可以是使用G418抗生素篩選細胞。

優選地，所述步驟(1)中CD63通過pCD63-3*Flag導入目標細胞，所述pCD63-3*Flag通過載體、CD63片段和3flag片段按1:3:3的摩爾比加入到HB-infusion無縫克隆試劑獲得；

優選地，步驟(1)中所述細胞培養基組分如下：

優選地，所述氨基酸選自L-鹽酸精氨酸、L-鹽酸胱氨酸、甘氨酸、L-鹽酸組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸中的任意一種或幾種。

(2)離心后取上清液；離心后取出細胞碎片以及凋亡小體；