[發明專利]外泌體的分離方法

在審

• 申請號: 201710167823.7
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106967747A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 陳意雄;朱鵬飛;蔡曉龍;鄒杰
• 申請（專利權）人: 上海科維創生物科技有限公司;漢恒生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N5/071
• 代理公司: 常州市權航專利代理有限公司32280
• 代理人: 黃晶晶

1.一種外泌體的分離方法，其特征在于，所述分離方法至少包括以下步驟：

向目標細胞中導入帶有標簽的CD63，使用細胞培養基進行培養；

離心后取上清液；

向上清液中加入磁性體，所述磁性體上含有能夠與CD63上的標簽特異性結合的標記物，孵育；

將上清液置于磁場中；

去除上清液后加入緩沖液，加入分選柱，利用緩沖液洗脫分選柱上滯留的外泌體，并收集。

2.根據權利要求1所述的外泌體的分離方法，其特征在于：所述標簽選自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一種或幾種。

3.根據權利要求1所述的外泌體的分離方法，其特征在于：所述步驟（1）還包括以下技術特征中的任意一種或幾種：

所述CD63通過載體攜帶導入目標細胞；

向目標細胞中導入帶有標簽的CD63后培養12~36h，然后篩選出含有CD63的陽性克隆細胞，再繼續培養陽性克隆細胞。

4.根據權利要求1所述的外泌體的分離方法，其特征在于：所述步驟（2）還包括以下技術特征中的任意一種或幾種：

離心前清洗細胞；

所述離心的條件為1000g離心5min，隨后4℃12000g離心30min；

向離心后的上清液中加入緩沖液。

5.根據權利要求1所述的外泌體的分離方法，其特征在于：所述步驟（3）中孵育的溫度為2~5℃，時間15~20分鐘。

6.根據權利要求1所述的外泌體的分離方法，其特征在于：所述步驟（4）將上清液置于磁場中的同時離心，離心的條件為1500~4500 r/min，時間5~20 min。

7.根據權利要求1所述的外泌體的分離方法，其特征在于，所述步驟（1）中CD63通過pCD63- 3*Flag導入目標細胞，所述pCD63- 3*Flag通過載體、CD63片段和3flag片段按1:3:3的摩爾比加入到HB-infusion無縫克隆試劑獲得。

8.根據權利要求1所述的外泌體的分離方法，其特征在于，所述步驟（1）中所述細胞培養基包括以下組分：

無水氯化鈣265mg/L

氯化鉀400 mg/L

無水硫酸鎂97 mg/L

氯化鈉6400 mg/L

無水磷酸二氫鈉109 mg/L

丁二酸75 mg/L

丁二酸鈉100 mg/L

氨基酸990 mg/L

葡萄糖1000 mg/L

酚紅9.30.00 mg/L

丁酸鈉20 mg/L。

9.根據權利要求8所述的外泌體的分離方法，其特征在于，所述氨基酸選自L-鹽酸精氨酸、L-鹽酸胱氨酸、甘氨酸、L-鹽酸組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸中的任意一種或幾種。