[發明專利]一種固定化的熒光標記細胞色素c、其制備方法及用途

在審

• 申請號: 201710166931.2
• 申請日: 2017-03-20
• 公開（公告）號: CN106950209A
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: 唐乾;曹洪玉;王立皓;鄭學仿
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙)21235
• 代理人: 胡景波

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種熒光標記的細胞色素c的固定化方法，以及所述固定化的熒光標記細胞色素c在生物樣品檢測中的用途。

背景技術

一氧化氮(NO)是具有多種生物活性的信使分子和效應分子，對心腦血管系統、消化系統、神經系統都具有重要的調節作用，近來研究表明NO還能發揮非特異性宿主防御作用，介導組織損傷、細胞凋亡等病理過程，進而引起炎癥反應和自身免疫性皮膚病。NO雖然結構簡單，但在有氧環境下極不穩定，檢測難度大，因而相關分析方法的研究極大的關注，CN105153214提供了一種硅基羅丹明一氧化氮熒光探針、CN103923641提供了一種檢測線粒體中一氧化氮的熒光探針。

細胞色素c是一種定位于線粒體內外膜間隙的血紅素蛋白，廣泛存在于各種含線粒體呼吸鏈的生物體中。細胞色素c含有c型血紅素，能夠與NO通過配位反應完成各種生理功能。早期的研究表明細胞色素c能夠直接與NO結合與解離。

目前，發明人前期針對細胞色素c與NO反應機制的研究發現NO進入溶液以NO形式存在，使Cyt c周圍的微環境發生變化，進入到Heme腔中改變其電子分布，增大了Met80與Heme之間的距離，使其相互作用減弱，Met與Heme之間的配位鍵改變，分子間發生重排，其中心Fe與NO形成新配位鍵，但所形成的Fe-N鍵不穩定，當NO量較少時，隨時間變化又會斷裂，再次生成五配位Fe，可以與溶液中的自由基團結合，最終達到一個平衡，當不斷通入NO時，所形成的配位鍵不再發生斷裂，破壞了其達到的平衡。

在對上述結合機制進行深入研究的基礎上進一步發現，由于Cyt c與NO的配位反應伴隨著空間構象的改變、配位鍵的形成，因此在不破壞細胞色素c結構和與NO結合活性的基礎上，用熒光標記細胞色素c將能夠用于檢測細胞色素c與NO結合過程中的能量轉移。

目前，國內外還沒有利用固定化熒光標記的細胞色素c來檢測一氧化氮的方法和產品。

發明內容

針對現有技術中的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種固定化的熒光標記細胞色素c，通過細胞色素c與NO的配位反應，引起細胞色素c構象的改變和能量的遷移，進而導致熒光光密度的改變，從而實現NO的檢測。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案如下：

本發明提供一種熒光標記細胞色素c的固定化方法，包括以下步驟：

(1)從微生物中提取純化細胞色素c；

(2)將細胞色素c與熒光素反應制備熒光標記的細胞色素c，除去游離熒光素；

(3)用異丙醇鋁制備鋁膠母液；

(4)將步驟(2)和(3)的產物混勻，涂布固相載體。

其中，所述細胞色素c來自光合細菌。

所述熒光標記細胞色素c的固定化方法，所述細胞色素c包含的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述熒光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(1)具體為：將菌體凍融后，超聲破碎，上清液過離子交換色譜，洗脫液再過分子篩層析，獲得電泳純的細菌源細胞色素c。

所述熒光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(2)具體為：將1mg細胞色素c溶解于NaHCO₃溶液中，加入5μl 20mM的熒光素琥珀酰亞胺酯，混勻，4℃反應2h，0.01M的pH7.4磷酸鹽緩沖液透析，除去未結合的游離熒光素二乙酸酯。

所述熒光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(3)具體為：取2g異丙醇鋁，加入44ml沸水中，80℃攪拌45min，加入1.2mL 1M的HCl，煮沸1h，冷卻至4℃。

所述熒光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(4)具體為：取等量的步驟(2)和(3)的產物混勻，4℃反應1h，均勻涂覆于固相載體表面。

本發明第二個目的是：提供通過所述熒光標記細胞色素c的固定化方法制備的固定化熒光標記細胞色素c。

本發明第三個目的是：提供上述熒光標記細胞色素c的固定化方法在制備檢測生物樣品中NO的檢測試劑中的用途。

本發明第四個目的是：提供上述熒光標記細胞色素c的固定化方法在制備檢測生物樣品中NO的檢測裝置中的用途。

本發明所述檢測生物樣品中NO的檢測裝置為細胞色素c珠、細胞色素c片、細胞色素c容器或細胞色素c傳感器。