[發(fā)明專利]一種雙功能性噬菌體及用途

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• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN106906187A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發(fā)明（設計）人: 毛傳斌;李龑;楊明英
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A61K47/69;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

技術領域

本發(fā)明屬于納米醫(yī)學領域，涉及一種雙功能性噬菌體及其在抑制腫瘤生長方面的用途。

背景技術

1979年哈佛大學Folkman博士提出了著名的腫瘤血管生成假說，經(jīng)過近三十年的研究被接受。該假說認為腫瘤在缺氧等的情況下會高表達一系列內(nèi)源性血管生成因子，而靜止的內(nèi)皮細胞被這些細胞因子激活以后經(jīng)過細胞增殖、遷徙并排列成管腔結(jié)構。腫瘤體積增長和轉(zhuǎn)移需要依靠這些新生的血管來提供營養(yǎng)，排除代謝物和提供路徑。這個假設被很多實驗證明：雞胚胎絨毛膜(CAM)上的腫瘤在無血管期生長受限，但在血管形成以后迅速生長；小鼠皮下移植腫瘤體積在血管形成前呈線性增加，在血管形成后呈指數(shù)增加；小鼠的皮下腫瘤生長過程血管占腫瘤體積增加，最后達到1.5％；體外球狀腫瘤在無血管的情況下只能達到2mm³，在體內(nèi)直徑也只能達到0.4mm；乳腺癌中血管血管內(nèi)皮細胞增殖比癌旁間質(zhì)內(nèi)皮細胞快45倍；在血管形成前血液中的循環(huán)腫瘤細胞極少，僅在血管化后才大量出現(xiàn)；腫瘤的新生血管基底膜不連續(xù)呈碎片狀，易于“滲漏”腫瘤細胞；新生血管分泌的膠原酶和血漿纖溶酶原激活物還協(xié)助腫瘤細胞侵襲周圍結(jié)蹄組織和淋巴管。故血管生成因子是腫瘤治療的一個很重要的靶點：通過中和、抑制重要的血管生成因子(如：VEGF)來抑制腫瘤新血管形成，從而達到“饑餓”腫瘤的目的。

絲狀噬菌體是一種由外殼蛋白圍繞基因組形成的900nm、直徑為6.5nm的生物納米纖維。它像其他納米顆粒一樣具有較大的比表面積，所以能攜帶大量的分子藥物；同時，它分子量較大具有很強的免疫原性，比較容易機體產(chǎn)生免疫反應，很容易被機體清除。因為噬菌體是特異性針對細菌的病毒顆粒，所以對人體而言是一種安全的納米材料。并且噬菌體還可以通過噬菌體展示技術和生物淘選獲得與目標靶向物(如：納米顆粒、蛋白質(zhì)、細胞和器官)特異性識別的結(jié)合肽。故絲狀噬菌體是一種具有巨大潛能的靶向阻斷藥物載體。但目前很多研究只利用了它的靶向性，而未嘗試在一個噬菌體上同時展示靶向性功能肽和治療性功能肽。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種雙功能性噬菌體及用途。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：一種雙功能性噬菌體，它通過以下方法制備得到：

(1)利用噬菌體多肽文庫，通過生物淘選篩選出針對人血管內(nèi)皮生長因子的特異性結(jié)合肽WR；

(2)將步驟(1)中的WR多肽和能特異性識別原位乳腺癌腫瘤的AR多肽分別展示在雙展示噬菌體fd388的p3和p8蛋白上，形成雙功能性噬菌體fd388-AR-WR。

一種上述雙功能性噬菌體在制備抑制腫瘤生長藥物方面的用途。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明利用生物淘選技術篩選獲得了能與VEGF蛋白特異結(jié)合的多肽(WR)，并將該多肽和一個人乳腺癌特異識別肽通過噬菌體展示技術分別展示在噬菌體的p8和p3位置并制備出了能同時結(jié)合腫瘤和VEGF的雙功能性噬菌體；該噬菌體既能特異地識別腫瘤還能阻斷腫瘤細胞分泌的VEGF進入腫瘤周圍的血管內(nèi)皮細胞，從而抑制腫瘤周圍的新血管的形成。通過該技術使腫瘤細胞得不到足夠的營養(yǎng)物質(zhì)而不能增殖，不能順利通過毛細血管實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)藥物靶向性缺乏，成本高，制備復雜等缺點。

附圖說明

圖1為fd388-AR-WR雙功能性噬菌體的TEM圖；

圖2為腫瘤經(jīng)過fd388-AR-WR雙功能性噬菌體治療后重量統(tǒng)計圖；

圖3為腫瘤經(jīng)過fd388-AR-WR雙功能性噬菌體治療后的直觀圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。

實施例1：

1、生物淘選：

1.1、使用0.1M NaHCO3包被液將VEGF蛋白稀釋成四個梯度濃度20g/mL、4g/mL、0.8g/mL、0.16g/mL。

1.2、將400μL的濃度為20g/mL的蛋白溶液孵育在24孔細胞培養(yǎng)板中4℃過夜。

1.3、棄掉蛋白溶液，加入500μL的5mg/mL BSA溶液，37℃封閉2小時；棄掉封閉液。

1.4、加入500μL的吐溫-20的體積百分比為5％的PBST溶液孵育6分鐘，棄掉，重復6次。

1.5、將含有10¹⁰pfu噬菌體庫的400μL PBS作為輸入加入，37℃封閉1小時，棄掉上清液。

1.6、加入500μL的吐溫-20的體積百分比為5％的PBST溶液孵育6分鐘，棄掉，重復6次，洗掉未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的噬菌體。