[發明專利]一種雙功能性噬菌體及用途

在審

• 申請號: 201710161741.1
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN106906187A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 毛傳斌;李龑;楊明英
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A61K47/69;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種雙功能性噬菌體，其特征在于，它通過以下方法制備得到：

(1)利用噬菌體多肽文庫，通過生物淘選篩選出針對人血管內皮生長因子的特異性結合肽WR；

(2)將步驟(1)中的WR多肽和能特異性識別原位乳腺癌腫瘤的AR多肽分別展示在雙展示噬菌體fd388的p3和p8蛋白上，形成雙功能性噬菌體fd388-AR-WR。

2.根據權利要求1所述的雙功能性噬菌體，其特征在于，所述步驟1包括以下子步驟：

(1.1)使用0.1M NaHCO₃包被液將VEGF蛋白稀釋成四個梯度濃度20g/mL、4g/mL、0.8g/mL、0.16g/mL。

(1.2)將400μL的濃度為20g/mL的蛋白溶液孵育在24孔細胞培養板中4℃過夜。

(1.3)棄掉蛋白溶液，加入500μL的5mg/mL BSA溶液，37℃封閉2小時；棄掉封閉液。

(1.4)加入500μL吐溫-20體積濃度為5％的PBST溶液孵育6分鐘，棄掉，重復6次。

(1.5)將含有10¹⁰pfu噬菌體庫的400μL PBS作為輸入加入，37℃封閉1小時，棄掉上清液。

(1.6)加入500μL吐溫-20體積濃度為5％的PBST溶液孵育6分鐘，棄掉，重復6次，洗掉未結合的和非特異性結合的噬菌體。

(1.7)加入400μL的pH＝2.2、濃度為0.1M的鹽酸孵育5-10分鐘，將特異結合的噬菌體洗脫下來；然后立即加入60μL的pH＝9.1、濃度為1M Tris-HCl溶液中和，將得到的噬菌體通過侵染細菌進行擴增，得到擴增后的噬菌體，完成第一輪篩選。

(1.8)依次用步驟1.1的濃度為4g/mL、0.8g/mL、0.16g/mL的蛋白溶液按步驟1.2-1.7完成第2-4輪的篩選，每輪篩選的輸入為上一輪得到的擴增后的噬菌體。

(1.9)經過四輪篩選獲得一些與VEGF特意結合的噬菌體，然后將這些噬菌體的基因組進行DNA測序。

(1.10)將步驟1.9中DNA測序出現頻率出現高的噬菌體和VEGF蛋白進行噬菌體ELISA實驗和斑點雜交實驗，與VEGF具有最高的親和力的噬菌體為攜帶有WR多肽的噬菌體；所述WR多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1所述的雙功能性噬菌體，其特征在于，所述步驟2具體為：將編碼WR多肽的雙鏈互補DNA序列兩端添加PstI/HindIII酶切位點，編碼乳腺癌腫瘤特異識別多肽(AR，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)的DNA序列兩端添加SfiI酶切位點。WR多肽對應的雙鏈互補DNA序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.11所示，AR多肽對應的雙鏈互補DNA序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.12所示；將fd388噬菌體展示載體利用PstI和HindIII酶切，并與帶有PstI/HindIII酶切位點的編碼WR多肽的DNA片段通過T4連接酶進行連接；成功插入WR多肽對應DNA的fd388-WR，再使用SfiI進行酶切，并與帶有SfiI酶切位點的編碼AR多肽的DNA片段連接形成fd388-AR-WR雙功能性噬菌體的基因組；然后將該基因組轉化入大腸桿菌中轉錄、翻譯、組裝成雙功能性噬菌體；最后將構建好的噬菌體加入含有PEG8000和NaCl的溶液中進行純化，噬菌體與溶液的體積比為6:1；溶液中，PEG8000的質量濃度為16.7％，NaCl的摩爾濃度為3.3M。所述噬菌體雙展示載體的序列如SEQ ID NO.10所示。