[發明專利]一種用于高效快速擴增cDNA末端的錨定引物及擴增方法

有效

• 申請號: 201710159826.6
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN106868005B
• 公開（公告）日: 2020-07-21
• 發明（設計）人: 蔡木炎;項志成;謝丹;王鳳偉;陳杰偉;凌逸虹;李鵬
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

1.一種用于高效快速擴增cDNA 5’末端的錨定引物，其特征在于，所述5’末端錨定引物的序列末端含3個鳥嘌呤，其中前兩個鳥嘌呤為單脫氧鳥嘌呤，最末端的一個鳥嘌呤為鎖核酸修飾鳥嘌呤；所述5’末端錨定引物的序列自身形成3’末端部分突出的莖環狀結構；所述5’末端錨定引物的序列為ATGCAGACGATTCTACGCTGTGTTCTArGrG+G。

2.如權利要求1所述的用于高效快速擴增cDNA 5’末端的錨定引物，其特征在于，所述5’末端錨定引物的序列與所有物種轉錄本不存在特異性結合區。

3.如權利要求1所述的用于高效快速擴增cDNA 5’末端的錨定引物，其特征在于，所述5’末端錨定引物的序列末端與cDNA 5’末端的胞嘧啶堿基互補配對，待M-MLV反轉錄酶合成cDNA至末端時，以所述5’末端錨定引物作為模板進行延伸。

4.一種高效快速擴增cDNA末端的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1～3任一項所述的用于高效快速擴增cDNA 5’末端的錨定引物以及用于高效快速擴增cDNA 3’末端的錨定引物。

5.如權利要求4所述的一種高效快速擴增cDNA末端的試劑盒，其特征在于，所述用于高效快速擴增cDNA 3’末端的錨定引物序列末端連接30個dT，并且所述3’末端錨定引物序列自身不形成發夾結構；且錨定引物序列與所有物種轉錄本不存在特異性結合區。

6.如權利要求5所述的一種高效快速擴增cDNA末端的試劑盒，其特征在于，所述用于高效快速擴增cDNA 3’末端的錨定引物序列為CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC-(dT)30。

7.一種采用如權利要求4-6任一所述的試劑盒高效快速擴增cDNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)、采用所述用于高效快速擴增cDNA 5’末端的錨定引物擴增目的基因的5'末端的cDNA片段，得到5'末端的RACE產物；(2)、采用用于高效快速擴增cDNA3’末端的錨定引物擴增目的基因的3'末端的cDNA片段，得到3'末端的RACE產物；(3)、從步驟(1)和步驟(2)中獲得的2個有相互重疊序列的3'及5'末端的RACE產物中獲得全長cDNA，或通過分析RACE產物的3'和5'端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。

8.如權利要求7所述的一種高效快速擴增cDNA的方法，其特征在于，所述步驟(1)中得到5'末端的RACE產物的方法為：以用于高效快速擴增cDNA 5’末端的錨定引物作為上游引物，目的基因特異引物R-Primer作為下游引物，以合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環，把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來，得到5'末端的RACE產物；所述步驟(2)中得到3'末端的RACE產物的方法為：以目的基因特異引物F-Primer作為上游引物，用于高效快速擴增cDNA 3’末端的錨定引物作為下游引物，以合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環，把目的基因3'末端的cDNA片段擴增出來，得到3'末端的RACE產物。