[發明專利]一種用于高效快速擴增cDNA末端的錨定引物及擴增方法

有效

• 申請號: 201710159826.6
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN106868005B
• 公開（公告）日: 2020-07-21
• 發明（設計）人: 蔡木炎;項志成;謝丹;王鳳偉;陳杰偉;凌逸虹;李鵬
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

本發明公開一種用于高效快速擴增cDNA5’及3’末端的錨定引物，所述兩種錨定引物可特異性結合于靶核酸序列并引發反轉錄延伸反應，從而高效快速擴增出cDNA5’及3’末端，尤其可應用于低豐度轉錄本中cDNA的5’和3’末端快速擴增。另外，本發明還提供一種高效快速擴增cDNA5’及3’末端的試劑盒及擴增方法。

技術領域

本發明涉及一種cDNA末端的快速擴增方法，特別涉及一種用于高效快速擴增cDNA末端的錨定引物及擴增方法。

背景技術

全長基因的獲得是生物工程及分子生物學研究的一個重點。經典的 RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術是由Frohman等于1988年發明的一項技術，該技術可以有效獲得基因的全長序列。RACE基于RT-PCR技術，末端加入鎖定引物從RNA中獲取帶有與末端鎖定引物互補或相同序列的cDNA，再通過特異性引物進行PCR擴增從而獲得完整的cDNA5'和3'端序列。RACE技術原理簡單，它具有快捷、高效、廉價等優點。

在很多生物研究中，所研究的目的基因豐度往往很低，這種情況下傳統的 RACE技術就突顯其不足，如特異性差，擴增效率低等，因此從低豐度mRNA 通過轉錄獲得全長cDNA變得異常困難。因此，本領域迫切需要開發快捷、效率高、特異性好的cDNA 5’及3’末端擴增技術。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處而提供一種用于高效快速擴增cDNA末端的錨定引物，所述錨定引物可特異性結合于靶核酸序列并引發反轉錄延伸反應，從而高效快速擴增出cDNA 5’及3’末端。另外，本發明還提供一種高效快速擴增cDNA’末端的試劑盒及擴增方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為一種用于高效快速擴增cDNA 5’末端的錨定引物，所述5’末端錨定引物的序列末端含3個鳥嘌呤,其中前兩個鳥嘌呤為單脫氧鳥嘌呤，最末端的一個鳥嘌呤為鎖核酸修飾鳥嘌呤。

優選的，所述5’末端錨定引物的序列自身形成3’末端部分突出的莖環狀結構。

優選的，所述5’末端錨定引物的序列與所有物種轉錄本不存在特異性結合區。

優選的，所述5’末端錨定引物的序列末端與cDNA 5’末端的胞嘧啶堿基互補配對，待M-MLV反轉錄酶合成cDNA至末端時，以所述5’末端錨定引物作為模板進行延伸。

優選的，所述5’末端錨定引物的序列為：ATGCAGACGATTCTACGCT GTGTTCTArGrG+G。采用此5’末端錨定引物的序列，可擴增出一段長鏈非編碼RNA的全長cDNA，其UCSC數據庫的登錄號為TCONS_00027227，自命名為27227,其染色體定位position:chr19:22025306-22035178。

另一方面，本發明提供一種高效快速擴增cDNA末端的試劑盒，所述試劑盒含有權利要求1～5任一項所述的5’末端錨定引物以及3’末端錨定引物。

優選的，所述高效快速擴增cDNA末端的試劑盒中的3’末端錨定引物序列末端連接30個dT，并且所述3’末端錨定引物序列自身不形成發夾結構；且錨定引物序列與所有物種轉錄本不存在特異性結合區。

優選的，所述3’末端錨定引物序列為CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC-(dT) 30。

另一方面，本發明提供一種高效快速擴增cDNA的方法，所述方法包括以下步驟：(1)、擴增目的基因的5'末端的cDNA片段，得到5'末端的RACE產物； (2)、擴增目的基因的3'末端的cDNA片段，得到3'末端的RACE產物；(3)、從步驟(1)和步驟(2)中獲得的2個有相互重疊序列的3'及5'末端的RACE 產物中獲得全長cDNA，或通過分析RACE產物的3'和5'端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。