[發明專利]一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法

在審

• 申請號: 201710159595.9
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN108627577A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 姜宏梁;張楊
• 申請（專利權）人: 武漢宏韌生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞

本發明公開了一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，包括如下步驟：(1)血漿樣品前處理過程；(2)隨性標準曲線樣品的制備；(3)LC?MS/MS測定過程；(4)標準曲線及濃度計算方法。該方法采用沉淀前處理、LC?MS/MS質譜儀對人血漿中小檗堿的含量進行測定，操作簡單、分離效果好、定性準確、檢測靈敏度高。

技術領域

本發明涉及分析技術領域，具體涉及一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法。

背景技術

小檗堿又名黃連素，是一種異喹啉生物堿，是從毛莫科黃連屬植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分，具有杭菌作用，對多種革蘭陽性菌及陰性菌、結核桿菌和真菌均有抑制或殺滅作用，臨床上一般使用其鹽酸鹽，臨床用于清熱解毒、治療腸道感染與腹瀉，療效較好，較少副作用。近年來臨床研究拓寬了小檗堿的適應癥范圍，研究發現小檗堿不僅有顯著的降血糖作用，而且對糖尿病人伴有的合并癥高血壓、高血脂、血栓形成，對神經病變均有很好的防治作用，對人類肝癌細胞、艾氏腹水瘤、結腸癌細胞、食道癌細胞系、鼻咽癌細胞、膀胱癌細胞、惡性畸胎瘤細胞等都具有一定的抑制和殺滅作用，單用于降血壓、降血脂，治療心律失常、充血性心力衰竭、抗炎與免疫調節、抗腫瘤等也有顯著療效。隨著小檗堿新的臨床應用的拓展，為了臨床用藥的安全性和有效性，有必要對小檗堿在人體內的含量及其藥代動力學進行研究，從而了解小檗堿的體內過程，確保用藥安全。

由于液相色譜-質譜/質譜(LC-MS/MS)法可以克服背景干擾，對復雜樣品仍可達到很高的靈敏度，且具有分辨率高、質量范圍寬、掃描快等優點，LC-MS/MS已成為現代分析手段中必不可少的組成部分。因此本發明建立準確、可靠、高效的人血漿樣品中小檗堿的含量LC-MS/MS檢測方法，并將該方法應用于小檗堿的藥物代謝動力學研究，為小檗堿的臨床藥用研究奠定技術基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，該方法采用LC-MS/MS質譜儀對人血漿中小檗堿的含量進行測定，操作簡單、定性準確、檢測靈敏度高。

本發明的技術方案為：一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，包括如下步驟：

(1)血漿樣品前處理過程：取20.0～60.0μL人血漿樣品，加入濃度為200ng·mL-1內標甲苯磺丁脲工作溶液，再加入200-400μL乙腈沉淀劑，渦旋混合3-5分鐘，于3～8℃的離心機中高速離心3～5分鐘，取上清液并向上清液中加入體積比1:1的甲醇水溶液，渦旋混合3～5分鐘，進行LC-MS/MS分析；

(2)隨性標準曲線樣品的制備：等量取數份200-300μL人空白血漿，分別等量加入不同濃度鹽酸小檗堿工作溶液5-15μL，渦旋混勻，逐級配制成鹽酸小檗堿濃度在0.05-100ng·mL-1之間的校正標樣及質控樣品，分別注入LC-MS/MS中進行測定；

(3)LC-MS/MS測定過程：

a.液相色譜條件：色譜柱為UItimateXB C18；流動相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸銨的水溶液；流動相B：乙腈；柱溫箱溫度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色譜柱平衡狀態時的柱壓：250-400bar；洗脫方式為梯度洗脫；

b.質譜條件：離子源為ESI源，采用正離子模式、多反應監測模式；電噴霧電壓：4500～5500V；渦旋離子噴霧溫度：550～650℃；氣簾氣種類：30psi；碰撞池氣體：中級；霧化氣種類Gas1：45psi；輔助氣Gas 2：65psi；數據收集時間：2～5min。

(4)標準曲線及濃度計算方法：根據步驟(2)所述校正標樣的檢測結果制作標準曲線，用步驟(2)所述質控樣品的檢測結果對標準曲線進行檢測；所述標準曲線以鹽酸小檗堿和內標甲苯磺丁脲的色譜峰面積比為縱坐標，以人血漿中鹽酸小檗堿的濃度為橫坐標，根據標準曲線計算人血漿樣品中小檗堿的含量。