[發明專利]一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法

在審

• 申請號: 201710159595.9
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN108627577A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 姜宏梁;張楊
• 申請（專利權）人: 武漢宏韌生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞

1.一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)血漿樣品前處理過程：取20.0～60.0μL人血漿樣品，加入濃度為200ng·mL-1內標甲苯磺丁脲工作溶液，再加入200-400μL乙腈沉淀劑，渦旋混合3-5分鐘，于3～8℃的離心機中高速離心3～5分鐘，取上清液并向上清液中加入體積比1:1的甲醇水溶液，渦旋混合3～5分鐘，進行LC-MS/MS分析；

(2)隨性標準曲線樣品的制備：等量取數份200-300μL人空白血漿，分別等量加入不同濃度鹽酸小檗堿工作溶液5-15μL，渦旋混勻，逐級配制成鹽酸小檗堿濃度在0.05-100ng·mL-1之間的校正標樣及質控樣品，分別注入LC-MS/MS中進行測定；

(3)LC-MS/MS測定過程：

a.液相色譜條件：色譜柱為UItimateXB C18；流動相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸銨的水溶液；流動相B：乙腈；柱溫箱溫度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色譜柱平衡狀態時的柱壓：250-400bar；洗脫方式為梯度洗脫；

b.質譜條件：離子源為ESI源，采用正離子模式、多反應監測模式；電噴霧電壓：4500～5500V；渦旋離子噴霧溫度：550～650℃；氣簾氣種類：30psi；碰撞池氣體：中級；霧化氣種類Gas1：45psi；輔助氣Gas 2：65psi；數據收集時間：2～5min；

(4)標準曲線及濃度計算方法：根據步驟(2)所述校正標樣的檢測結果制作標準曲線，用步驟(2)所述質控樣品的檢測結果對標準曲線進行檢測；所述標準曲線以鹽酸小檗堿和內標甲苯磺丁脲的色譜峰面積比為縱坐標，以人血漿中鹽酸小檗堿的濃度為橫坐標，根據標準曲線計算人血漿樣品中小檗堿的含量。

2.根據權利要求1所述的一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于：步驟(1)所述內標甲苯磺丁脲工作溶液按如下方法制備得到：稱取內標甲苯磺丁脲至玻璃瓶中，加入甲醇配制成濃度為1.00mg·mL-1的內標甲苯磺丁脲儲備液，置于在0～10℃下保存備用；用體積比1:1的甲醇水溶液將內標甲苯磺丁脲儲備液稀釋成200ng·mL-1的內標甲苯磺丁脲工作溶液；所述內標甲苯磺丁脲工作溶液于在0～10℃保存。

3.根據權利要求1所述的一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于：步驟(2)所述鹽酸小檗堿工作溶液按如下方法制備得到：稱取鹽酸小檗堿對照品至玻璃瓶中，加入甲醇配制成濃度為250μg·mL-1的儲備液；將配制好的鹽酸小檗堿儲備液用體積比1:1的甲醇水溶液逐級稀釋成濃度為25.0μg·mL-1的工作溶液，再逐級稀釋成不同濃度的鹽酸小檗堿工作溶液；所述鹽酸小檗堿工作溶液于在0～10℃保存。

4.根據權利要求1所述的一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述LC-MS/MS測定過程中鹽酸小檗堿的監測離子對為336.0/320.0，每次掃描一個離子對時所停留的時間150msec，去簇電壓34.0eV，碰撞能量35.0eV。

5.根據權利要求1所述的一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述LC-MS/MS測定過程中內標甲苯磺丁脲的監測離子對為271.1/91.0，每次掃描一個離子對時所停留的時間20msec，去簇電壓37.0eV，碰撞能量44.0eV。

6.根據權利要求1所述的一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于：步驟(1)所述離心機轉速≥10000×g。

7.根據權利要求1所述的一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于：步驟(2)中，所述校正標樣的濃度分別為：50.0、40.0、25.0、5.00、2.00、0.500、0.100和0.0500ng·mL-1；所述質控樣品的濃度分別為37.5、2.50和0.150ng·mL-1。

8.根據權利要求1所述的一種人血漿中小檗堿含量的定量檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述色譜條件還包括：自動進樣器清洗溶液為甲醇，壓腳提升量：50mm；自動進樣器溫度：4.0℃；自動進樣器清洗模式：進樣前清洗和進樣后清洗；自動進樣器洗針體積：400μL；自動進樣器進樣針清洗時浸泡時間：2seconds；自動進樣器進樣體積：6.00μL。