[發明專利]用于構建測序文庫的接頭核酸分子

有效

• 申請號: 201710158081.1
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN108624666B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 張東
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

本發明提出了一種用于構建測序文庫的接頭核酸分子。該核酸分子包括第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含PCR反應斷點，所述PCR反應斷點包括選自下列的至少之一：(1)核酸消化酶特異性識別位點；以及(2)DNA聚合酶不識別位點。本申請所述的接頭核酸分子可以應用于低起始量樣品的建庫，適應更寬的mRNA含量的變化。利用本申請所述的接頭核酸分子進行構建測序文庫，能夠有效清除測序文庫中的接頭互連、自連產物，降低接頭互連、自連產物在測序數據的比例。

技術領域

本發明涉及生物測序領域，具體地，本發明涉及用于構建測序文庫的接頭核酸分子，更具體地，本發明涉及構建測序文庫的接頭核酸分子、構建測序文庫的方法、測序文庫、核酸樣本測序方法、構建測序文庫的設備以及用于對核酸樣本進行測序的系統。

背景技術

Illumina公司的Truseq RNA librarykit做RNA測序具有很好靈敏度，能適應很多物種的RNA建庫，但是由于不同物種、生理、發育、組織、分化等條件下，其總RNA的mRNA含量會不一樣，實踐中當遇到某些樣品的mRNA含量很低時，此kit的建庫產物就會出現一些奇怪的產物。現階段的RNA檢測技術又難以特異性地對mRNA含量進行定量，特別是對于總RNA量本來就很少的樣品來說，還面臨檢測靈敏度不夠的問題。

因此，如何提高建庫產物的質量以及如何提高測序的靈敏度是科學工作者拭待解決的關鍵問題。

發明內容

本申請是基于發明人對以下問題和事實的發現而提出的。

為調查尖峰形成原因，發明人在實驗中模擬不同的mRNA含量，分別用200ng、20ng的UHRR(RNA標準品)起始mRNA量進行建庫。發明人發現，20ng文庫經Hiseq平臺上測序后，文庫測序堿基波動很大，測序質量很差。后經對文庫測序的reads序列進行分析發現，這些“鋸齒”狀的尖峰實則為DNA接頭的互連、自連接產物，而因接頭互連、自連個數、組合方式的不同，而形成長短不一的產物，Agilent2100檢測后就呈“ladder”狀顯現。已知接頭長度約62nt，而實測這些“ladder”狀的尖峰的長度間距也接近62nt。這些尖鋒是建庫所使用的DNA接頭的不同個數、不同組合的連續互連、自連的產物。

但在測序中，有明顯“ladder”峰的通常視為不合格，如果冒險嘗試上機，則堿基波動很大，測序質量不好，接頭序列(被視為empty-reads)數據占比高達30％以上。如果“ladder”峰的大小不明顯而隱藏在文庫里面，也會使測序時的堿基波動很大，嚴重影響測序質量，增加數據中的接頭序列比例，影響有效數據的產出(empty-reads占比)。因此，文庫中的接頭互連、自連產物嚴重影響了測序質量，發明人需要進一步有效消除此成分，以此來提高測序質量。

而現有的消除接頭互連、自連產物的方法包括(1)利用DNA片段長短的差別，通過電泳切膠分離法，去除引物二聚體，進而選擇在一定長度范圍的目的片段；(2)利用DNA片段長短的差別，通過磁珠的吸附，篩選去除二聚體、選擇在一定長度范圍的目的片段。但現有的方法(1)切膠操作低效，所需時間長，如電泳要2小時，切膠及產物回收需30分鐘；(2)DNA接頭互連、自連的產物，會因接頭連接個數、組合不同而長度不一，大小相差約為62nt，產物長度會與目的文庫的片段長度重疊，摻雜在一起，難以用片段長度差異篩選的原理進行分選。

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本申請的發明人通過巧妙地設計接頭序列，利用核酸消化酶特異性識別堿基位點的原理或DNA聚合酶不識別特異性堿基位點的原理，實現有效清除文庫中的接頭互連、自連產物，從而降低接頭互連、自連產物在測序數據的比例。該清除步驟過程相比于現有技術，更加快速、簡單，不需要切膠，不產生EB污染，并且能夠有效消除了文庫Agilent2100質檢的互連、自連產物存在的導致數據質量差的隱患。