[發(fā)明專利]用于構(gòu)建測序文庫的接頭核酸分子

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710158081.1
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN108624666B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張東
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.一種用于構(gòu)建測序文庫的接頭核酸分子，其特征在于，包括：

第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含PCR反應(yīng)斷點(diǎn)，所述PCR反應(yīng)斷點(diǎn)包括選自下列的至少之一：

(1)核酸消化酶特異性識別位點(diǎn)；以及

(2)DNA聚合酶不識別位點(diǎn)；

所述接頭核酸分子進(jìn)一步包含：

第二核酸鏈，所述第一核酸鏈與所述第二核酸鏈的至少一部分形成雙鏈區(qū)，并且所述雙鏈區(qū)的一端構(gòu)成所述接頭核酸分子的連接反應(yīng)末端；

所述的第二核酸鏈進(jìn)一步包含位于5’端的PCR反應(yīng)斷點(diǎn)，第二核酸鏈包含的PCR反應(yīng)斷點(diǎn)包括選自下列的至少之一：

(1)核酸消化酶特異性識別位點(diǎn)；以及

(2)DNA聚合酶不識別位點(diǎn)；

所述第一核酸鏈包含的核酸消化酶特異性識別位點(diǎn)位于PCR引物互補(bǔ)區(qū)域毗鄰的第一核酸鏈的3’區(qū)域；

所述第一核酸鏈包含的DNA聚合酶不識別位點(diǎn)位于PCR引物互補(bǔ)區(qū)域或者PCR引物互補(bǔ)區(qū)域毗鄰的第一核酸鏈的3’區(qū)域；

所述的核酸消化酶選自UNG酶或USER酶；

所述PCR反應(yīng)斷點(diǎn)為UU。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸消化酶為USER酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，DNA聚合酶為Pfu DNA 聚合酶或deepventDNA 聚合酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述第一核酸鏈為SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

所述第二核酸鏈為SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

5.一種構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，包括：

將待測序的DNA片段與接頭連接，以便獲得連接產(chǎn)物，所述接頭為權(quán)利要求1~4中任一項所述的核酸分子；以及

對所述連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增處理，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，

其中，所述擴(kuò)增處理中，基于所述PCR反應(yīng)斷點(diǎn)，去除接頭自連或互連產(chǎn)物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)斷點(diǎn)包括核酸消化酶特異性識別位點(diǎn)，所述擴(kuò)增處理進(jìn)一步包括：

（1）利用所述核酸消化酶對所述連接產(chǎn)物進(jìn)行消化處理，以便獲得消化產(chǎn)物；

（2）從所述消化產(chǎn)物中去除長度不大于預(yù)定閾值的核酸片段；以及

（3）利用DNA聚合酶對經(jīng)過步驟（2）處理的所述消化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物，

所述核酸消化酶為USER酶和/或UNG酶，

所述從所述消化產(chǎn)物中去除長度不大于預(yù)定閾值的核酸片段是利用XP磁珠純化實(shí)現(xiàn)的。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)斷點(diǎn)包括DNA聚合酶不識別位點(diǎn)，所述PCR反應(yīng)進(jìn)一步包括：

(a)利用DNA聚合酶對所述連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得PCR擴(kuò)增粗產(chǎn)物；

(b)從所述PCR擴(kuò)增粗產(chǎn)物中去除長度不大于預(yù)定閾值的片段，以便獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物，

所述從所述PCR擴(kuò)增粗產(chǎn)物中去除長度不大于預(yù)定閾值的片段是利用XP磁珠純化實(shí)現(xiàn)的。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述待測序的DNA片段是通過如下方式獲得的：

1）將待測樣品的RNA進(jìn)行分離、純化和打斷處理；

2）對經(jīng)過步驟1）處理的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得cDNA，所述cDNA為所述待測序的DNA片段，

所述反轉(zhuǎn)錄是通過如下方式進(jìn)行的：

（A）以經(jīng)過步驟1）處理的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成DNA第一鏈，以便獲得RNA/DNA雜交鏈；

（B）利用RNaseH對RNA/DNA雜交鏈中的RNA鏈進(jìn)行消化處理；

（C）以步驟（B）消化處理后的殘余RNA鏈為引物，以所述DNA第一鏈為模板，反轉(zhuǎn)錄合成DNA第二鏈；

（D）利用RNaseH對步驟（C）產(chǎn)物進(jìn)行消化處理；以及

（E）將步驟（D）處理產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)齊處理，以便獲得所述cDNA。