[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710157198.8
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN107022526B
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余昌胤;匡巍;劉濤;余麗梅;龔其海
• 申請（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 北京聯(lián)創(chuàng)佳為專利事務(wù)所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防;王培境

本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法，包括以下步驟：(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制；(3)hAMSCs的分離與原代培養(yǎng)；(4)hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增；(5)hAMSCs表型檢測；(6)hAMSCs誘導(dǎo)分化。本發(fā)明提供的一種誘導(dǎo)hAMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的方法，能夠在體外高效誘導(dǎo)hAMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化。本發(fā)明的方法無需加用生長因子誘導(dǎo)，僅應(yīng)用淫羊藿次苷Ⅱ即可誘導(dǎo)hAMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，是一種通過單分子誘導(dǎo)劑高效誘導(dǎo)hAMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的方法。本發(fā)明方法具有誘導(dǎo)hAMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化率高的特點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法，具體屬于細胞工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人羊膜間充質(zhì)干細胞(humman amnion-derived mesenchymal stem cells，hAMSCs)是從娩出的胎盤附屬物羊膜中分離而得，具有部分胚胎干細胞的特征，表達Oct4、Nanog、SOX2等胚性標志分子，可分化為三個胚層不同類型的細胞；且因來源豐富，原為廢棄物，倫理爭議小，羊膜中所含羊膜間充質(zhì)干細胞數(shù)量級高，為再生醫(yī)學(xué)的一種新細胞資源。研究表明，采用經(jīng)典的體外誘導(dǎo)方案或移植到損傷的組織器官，hAMSCs不但可分化為心肌細胞、胰島細胞、肝細胞及神經(jīng)元細胞等，還具有免疫原性低、不表達CD80、CD86及HLA-DR等共刺激分子的優(yōu)點，并可分泌多種活性因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促進血管生成，改善微環(huán)境等作用，對肝腎損傷、心肌梗死、糖尿病及神經(jīng)元退行性疾病和多種自身免疫性疾病等都具有明顯治療作用，具有誘人的臨床應(yīng)用前景。目前國內(nèi)外報道了多種誘導(dǎo)hAMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的方法，諸如化學(xué)誘導(dǎo)法、細胞因子誘導(dǎo)法、細胞共培養(yǎng)法、中藥誘導(dǎo)法等。這些方法都需要加用生長因子誘導(dǎo)。因此，研究一種通過單分子誘導(dǎo)劑能高效率誘導(dǎo)hAMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的方法，顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法，能夠在體外高效誘導(dǎo)hAMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化。

為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法，包括以下步驟：(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制；(3)hAMSCs的分離與原代培養(yǎng)；(4)hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增；(5)hAMSCs表型檢測；(6)hAMSCs誘導(dǎo)分化。

前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法中，步驟(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制，具體為：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和0.6mL～2mLDMSO，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液。

優(yōu)選地，前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法中，取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和2mLDMSO，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液。

前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法中，步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制，具體為：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液或淫羊藿次苷Ⅱ母液和DMSO配制成1μmol/L～10μmol/L含體積濃度為0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法中，取100mLHG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成3μmol/L含體積濃度為0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

前述誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的方法中，步驟(3)hAMSCs的分離與原代培養(yǎng)，具體為：按照專利號為2011100809686的發(fā)明專利所述方法進行培養(yǎng)。本申請中分離和原代培養(yǎng)的方法，通過采用特定的酶消化濃度以及消化時間，使得hAMSCs的分離與原代培養(yǎng)效果最佳。