[發明專利]一種誘導人羊膜間充質干細胞向神經元樣細胞分化的方法

有效

• 申請號: 201710157198.8
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN107022526B
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發明（設計）人: 余昌胤;匡巍;劉濤;余麗梅;龔其海
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防;王培境

1.一種誘導人羊膜間充質干細胞向神經元樣細胞分化的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和0.6mL～2mLDMSO，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；

(2)誘導培養基的配制：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液或淫羊藿次苷Ⅱ母液和DMSO配制成1μmol/L～10μmol/L含體積濃度為0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ誘導培養基；

(3)hAMSCs的分離與原代培養：無菌條件下從胎盤組織上機械分離羊膜，用D-PBS沖洗殘留血跡，無菌操作臺內將新鮮羊膜放入到無菌方盤中，用載玻片輕輕刮除羊膜上殘留的血塊，將羊膜剪成1×1cm²大小的組織塊，放入50mL離心管中，按體積比1:1比例加入質量濃度為0.05％的胰酶，37℃恒溫搖床水浴消化40min，倒入200目細胞網過濾，棄去濾液，加入質量濃度為0.05％的胰酶再次消化40min，倒入200目濾網過濾，將濾網上的殘留組織按體積比為1:1的比例加入含0.075mg/mL DNaseI的0.75mg/mLⅡ型膠原酶，37℃恒溫搖床水浴消化90min，將消化好的組織倒入200目細胞網過濾，收集濾液，1500rpm離心10min，去上清，加入含血清的LG-DMEM/F12培養基吹打混勻，種在T75培養瓶中繼續培養，每隔2天更換培養基；

(4)hAMSCs的傳代培養與擴增：待細胞長滿培養瓶80％～90％，棄去培養基，用PBS清洗2次，加入質量濃度為0.125％胰酶，蓋過細胞即可，消化2～3min，待貼壁細胞收縮變圓，少許懸浮，加入與胰酶等體積的含血清LG-DMEM/F12培養基終止消化，用1mL移液槍輕輕吹打貼壁細胞，直至全部懸浮，吸入離心管中，在1500rpm條件下離心10min，棄去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培養基，輕輕吹打懸浮細胞，分瓶培養；

(5)hAMSCs表型檢測：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入熒光標記的抗人單抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相應的同型對照，混勻，避光孵育，PBS洗滌后，加入體積濃度為4％的多聚甲醛固定，BD Calliber流式細胞儀采集不少于1×10⁵個細胞，Cell Quest軟件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；

(6)hAMSCs誘導分化：取傳至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以質量濃度為0.125％胰酶消化懸浮細胞，調整細胞密度至4×10⁴個/mL，傳代接種于植入TC處理細胞爬片的12孔板內，加入含血清LG-DMEM/F12培養基培養，隔天換液，待細胞貼壁50％～60％時，吸去LG-DMEM/F12培養基，PBS洗2次，加入含體積濃度為0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ誘導培養基，隔60小時換液，誘導21天，即得。

2.根據權利要求1所述的誘導人羊膜間充質干細胞向神經元樣細胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制方法為：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和2mLDMSO，混勻后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液。

3.根據權利要求1所述的誘導人羊膜間充質干細胞向神經元樣細胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(2)誘導培養基的配制方法為：取100mL HG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成3μmol/L含體積濃度為0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ誘導培養基。