[發明專利]一種基于高內涵技術定量分析焦油致細胞DNA損傷的方法

在審

• 申請號: 201710156635.4
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106970051A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 侯宏衛;張森;胡清源;陳歡;王安;劉勇
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心;中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙)11382
• 代理人: 曹津燕,張偉

技術領域

本發明屬于DNA損傷體外檢測技術領域，更具體而言，本發明涉及焦油致細胞DNA損傷的體外定量分析方法。

背景技術

卷煙煙氣可按照物質的狀態分成兩相，一種為氣相，一種為粒相，粒相物質即為焦油。卷煙焦油中含有多種有毒物質，如超氧陰離子O·^-，過氧化氫等活性氧類物質，醛類，苯并芘等。焦油可以誘發多種癌癥和呼吸道疾病，其中的活性自由基和有毒物質可以誘導DNA產生氧化性損傷、DNA鏈斷裂、微核、基因突變等。所以，準確檢測焦油對細胞DNA的損傷對于焦油的遺傳毒性和危害性評價具有重要的意義。

DNA雙鏈斷裂是DNA最嚴重的一種損傷形式，如果這種損傷不能被正確或者及時修復就可能會導致染色體畸變或者細胞凋亡等。作為DNA雙鏈斷裂的一種生物標志物，磷酸化組蛋白γH2AX已經被廣泛地應用于臨床醫藥學、放射學及毒理學等研究方面。包括很多單體化合物和混合物通過γH2AX實驗對其遺傳毒性進行了測定和評價。例如，Tanaka等利用γH2AX實驗對卷煙煙氣冷凝物的遺傳毒性進行了檢測和評價；Smart等采用γH2AX實驗對依托泊苷、米托蒽醌及甲基亞硝脲的DNA雙鏈斷裂的劑量-效應關系進行了研究。該實驗因其靈敏性高、結合其他儀器檢測技術可以進行大規模分析檢測，擁有其他遺傳毒性檢測技術并不具備的多種優點，目前已經被廣泛地應用于化合物和有毒物質的遺傳毒性篩選和評價。

目前對γH2AX進行分析檢測的主要方法有流式細胞儀、ELISA(酶聯免疫吸附試驗)、Western Blot(蛋白質印跡)、顯微鏡技術等。流式細胞儀和Western Blot操作繁瑣，檢測前需要將貼壁細胞酶解成單細胞懸液，破壞了細胞的結構和功能完整性，且檢測通量較低。ELISA不能提供細胞內熒光焦點的分布情況且需要額外添加其他檢測蛋白對結果進行校正，而顯微鏡技術的檢測通量低，且人為計數的誤差較大。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的是提供一種無需破壞細胞、簡單、有效且靈敏度高的焦油致DNA損傷的定量分析方法，該方法的檢測結果準確并且可視化，以克服現有技術的缺陷。

本發明的目的通過將高內涵技術和γH2AX的定量分析相結合而實現。具體而言，本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種基于高內涵技術定量分析焦油致細胞DNA損傷的方法，所述方法包括以下步驟：

1)細胞培養：將細胞接種在細胞培養液中進行細胞培養；

2)細胞染毒：吸棄所述細胞培養液，加入細胞染毒液繼續培養，所述細胞染毒液包含焦油和細胞培養液；

3)免疫熒光標記：吸棄所述細胞染毒液，進行細胞中γH2AX的免疫熒光標記與細胞核的DAPI染色；

4)高內涵技術定量分析：分別進行所述細胞的細胞核和γH2AX的熒光測定，以所識別的有效細胞的有效細胞核內檢測到的平均熒光強度來表征γH2AX的含量。

優選地，所述步驟1)中，所述細胞為貼壁生長細胞；更優選地，接種時，所述細胞處于對數生長期，以單細胞懸液接種于細胞培養液中；

更優選地，細胞接種后將細胞在細胞培養液中于37℃，5％CO₂條件下培養24h。

優選地，所述步驟2)中，所述焦油通過以下方法制備：標準卷煙樣品于溫度(22±1)℃和相對濕度60％±3％下平衡48-72后，抽吸該卷煙樣品，收集總粒相物，然后加入DMSO(二甲基亞砜)配制成濃度為8-100mg/mL的煙氣粒相物溶液(焦油)，-80℃下保存備用。根據本發明的具體實施方式，所述標準卷煙樣品為3R4F。

優選地，所述細胞染毒液中焦油的濃度為0-500μg/mL，優選>0且≤500μg/mL，更優選為3.91-500μg/mL；

根據本發明的具體實施方式，所述細胞染毒液中焦油的濃度可以是0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250或500μg/mL。

優選地，在所述細胞染毒液中培養細胞1-24h、優選24h。

優選地，所述步驟3)包括：

3-1)吸棄所述細胞染毒液，洗滌細胞，加入多聚甲醛進行細胞固定；

3-2)洗滌細胞，然后加入Triton-100X以使細胞通透；

3-3)洗滌細胞，然后加入血清白蛋白封閉，之后加入一抗即抗γH2AX抗體進行孵育；

3-4)洗滌細胞，然后加入免疫熒光標記的二抗進行孵育；

3-5)洗滌細胞，加入DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)進行染色；

3-6)洗滌細胞，保存。