[發(fā)明專利]一種基于高內(nèi)涵技術(shù)定量分析焦油致細(xì)胞DNA損傷的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710156635.4
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106970051A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯宏衛(wèi);張森;胡清源;陳歡;王安;劉勇
• 申請（專利權(quán)）人: 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心;中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京瑞恒信達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11382
• 代理人: 曹津燕,張偉

1.一種基于高內(nèi)涵技術(shù)定量分析焦油致細(xì)胞DNA損傷的方法，所述方法包括以下步驟：

1)細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

2)細(xì)胞染毒：吸棄所述細(xì)胞培養(yǎng)液，加入細(xì)胞染毒液繼續(xù)培養(yǎng)，所述細(xì)胞染毒液包含焦油和細(xì)胞培養(yǎng)液；

3)免疫熒光標(biāo)記：吸棄所述細(xì)胞染毒液，進(jìn)行細(xì)胞中γH2AX的免疫熒光標(biāo)記與細(xì)胞核的DAPI染色；

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量分析：分別進(jìn)行所述細(xì)胞的細(xì)胞核和γH2AX的熒光測定，以所識別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)檢測到的平均熒光強(qiáng)度來表征γH2AX的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞；

優(yōu)選地，接種時，所述細(xì)胞處于對數(shù)生長期，以單細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中；

更優(yōu)選地，細(xì)胞接種后將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液中于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)24h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述焦油通過以下方法制備：標(biāo)準(zhǔn)卷煙樣品于溫度(22±1)℃和相對濕度60％±3％下平衡48-72h后，抽吸該卷煙樣品，收集總粒相物，然后加入DMSO(二甲基亞砜)配制成濃度為8-100mg/mL的煙氣粒相物溶液(焦油)，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述細(xì)胞染毒液中焦油的濃度為0-500μg/mL，優(yōu)選>0且≤500μg/mL，更優(yōu)選為3.91-500μg/mL；

優(yōu)選地，在所述細(xì)胞染毒液中培養(yǎng)細(xì)胞1-24h、優(yōu)選24h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟3)包括：

3-1)吸棄所述細(xì)胞染毒液，洗滌細(xì)胞，加入多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定；

3-2)洗滌細(xì)胞，然后加入Triton-100X以使細(xì)胞通透；

3-3)洗滌細(xì)胞，然后加入血清白蛋白封閉，之后加入一抗即抗γH2AX抗體進(jìn)行孵育；

3-4)洗滌細(xì)胞，然后加入免疫熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；

3-5)洗滌細(xì)胞，加入DAPI進(jìn)行染色；

3-6)洗滌細(xì)胞，保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中，所述細(xì)胞的細(xì)胞核和γH2AX的熒光測定分別在兩組不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長下進(jìn)行；

優(yōu)選地，所述步驟3-4)中，免疫熒光標(biāo)記的二抗為Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗，并且所述步驟4)中，在通道一中以激發(fā)波長358nm和發(fā)射波長461nm進(jìn)行細(xì)胞核的熒光測定，在通道二中以激發(fā)波長495nm和發(fā)射波長519nm進(jìn)行γH2AX的熒光測定，以獲得通道一所識別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)通道二所檢測的平均熒光強(qiáng)度，由此表征γH2AX的含量；

優(yōu)選地，在兩個通道中，測量倍數(shù)為200倍，每孔分析和測定9個視野。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，任選地，所述方法還包括，設(shè)置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對照組，從而在步驟4)中得到由非特異吸附引起的空白信號，由此從檢測到的熒光測定信號中扣除空白信號。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過在步驟2)中設(shè)置多種包含不同濃度的焦油的細(xì)胞染毒液，進(jìn)行所述方法，最后根據(jù)步驟4)獲得的γH2AX平均熒光強(qiáng)度和焦油的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過在步驟2)中將細(xì)胞在包含相同濃度的焦油的細(xì)胞染毒液中培養(yǎng)不同時間，進(jìn)行所述方法，最后根據(jù)步驟4)獲得的γH2AX平均熒光強(qiáng)度和培養(yǎng)時間繪制時間-效應(yīng)曲線。