[發明專利]一種高效的痕量臨床病人樣本的高通量全蛋白組學定量分析方法

在審

• 申請號: 201710155263.3
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN106885858A
• 公開（公告）日: 2017-06-23
• 發明（設計）人: 方雷;阮錦滿
• 申請（專利權）人: 方雷
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/06;G01N30/14;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬臨床醫學診斷技術領域，具體涉及一種痕量臨床病人樣本的蛋白組學模型及其構建方法和應用。

背景技術

2015年1月20日，時任美國總統奧巴馬在國情咨文演講中提出了“精準醫學(Precision Medicine)”計劃，旨在推動個體化基因組學研究，依據個人基因信息為癌癥及其他疾病患者制定個體醫療方案。簡單來說，“精準醫學”就是指根據每個病人的個人特征量體裁衣式地制定個性化治療方案。它是由“個性化醫療”聯合最新的遺傳檢測技術發展而來。遺傳檢測并不僅僅只是基因檢測，其范圍更廣，是對受檢者與相關微生物(如感染因子、共生微生物等)的遺傳物質(包括DNA、RNA、染色體)及其產物(如蛋白質、代謝物及小分子)進行檢測，為疾病診療、健康管理提供信息與線索。目前已有的一些新型基因組學標志物，包括全基因組DNA序列、全外顯子組DNA序列、表達譜、小RNA等，然而以蛋白質作為疾病標志物的仍然少之又少。究其原因，主要是臨床病人樣本在獲取時極其困難，樣本量又非常少，而蛋白質組學的研究對象蛋白質又無法像基因組學研究的DNA、RNA那樣可以通過PCR得到擴增，因此疾病蛋白標志物的開發受到極大的限制。

腎小球腎炎是腎臟疾病的主要類型，是指腎小球固有細胞增殖和(或)白細胞浸潤引起的以腎小球細胞成分增多為特征的一類疾病。根據發病機制和致病類型，腎小球腎炎分為5類：免疫復合物相關性腎小球腎炎、寡免疫復合物性腎小球腎炎、抗腎小球基膜腎炎、單克隆免疫球蛋白相關性腎小球腎炎和C3腎病。其中，免疫復合物相關性腎小球腎炎，是以特定類型的免疫復合物蛋白在腎小球的沉積為特征的一類疾病。目前在臨床上除了以免疫熒光結果(或不太常用的免疫組化結果)為基礎、并結合光鏡和電鏡結果進行診斷分型外，尚未開發出靈敏、精準和自動化的診斷手段。近年來，美國的梅奧醫學中心(Mayo Clinic)等頂尖醫療機構開始開發腎小球石蠟切片激光顯微切割結合質譜蛋白質組學的方法，對腎臟病病人腎小球的全蛋白組進行檢測后用于臨床診斷和分型，獲得了較好結果。但是，受限于腎小球石蠟切片激光顯微切割獲取到的蛋白量，這一檢測方法一般采取非標記蛋白質譜定量方法進行分析，只能檢測和定量到的幾十種不同的高豐度蛋白種類。另外，因為石蠟切片本身制作以及從中提取蛋白的過程復雜，步驟繁瑣，造成樣品不同程度的損失和引入誤差，嚴重影響質譜分析的結果和最終的疾病診斷。

同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ)是由美國SCIEX公司研發的一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術。該技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯分析，可同時比較多達8組樣品之間的蛋白表達量，對數千個蛋白一次完成自動定量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。然而，該技術對蛋白量的要求較高，一般每組樣品需要50μg以上的蛋白進行標記后混合，才能進行下游的HPLC分級，從而實現10³數量級的蛋白定量。然而，多數情況下，臨床穿刺獲得的病人組織樣品量非常少，還要用于切片、染色等病理分析，只有極微量的組織可供蛋白質組學檢測。痕量的組織樣本，如激光顯微切割獲取腎小球，肉眼觀察不明顯，且不易進行操作，又帶來一個總蛋白如何提取的新問題。因此，亟需針對此類痕量臨床病人樣本開發一整套從組織獲得、蛋白提取、蛋白酶解到蛋白質質譜高通量自動定量分析的技術。

發明內容

本發明專利需要解決的問題是臨床病人組織樣本量少，蛋白提取效率低，蛋白量少且難以利用蛋白質組學進行高通量、自動化疾病標志物和治療靶點篩選的技術障礙。

本發明的目的可以通過以下措施來達到：1.將手術獲得或穿刺活檢獲得的臨床病人組織根據需要進行激光顯微切割，獲取痕量的相同大小的組織。2.將痕量病人組織采用非接觸式超聲破碎高效提取總蛋白。3.將獲得的蛋白進行還原烷基化，并進行胰蛋白酶酶解。收集酶解肽段脫鹽后取微量肽段進行質譜分析，根據肽段數量對不同組蛋白的濃度完成相對定量。4.對不同組病人樣品按照流程進行iTRAQ試劑的標記，并真空抽干后進行痕量樣品的HPLC預分級。5.將HPLC分級獲得的肽段提交到在線二維液相色譜質譜聯用系統(2D-LC-MS/MS)進行全蛋白質組學定量分析。6.通過生物信息學工具分析，高通量高準確度的篩選和確認疾病標志物和治療靶點蛋白，真正通過質譜蛋白質組學手段實現精準醫學疾病診斷。