[發(fā)明專利]一種高效的痕量臨床病人樣本的高通量全蛋白組學(xué)定量分析方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710155263.3
• 申請(qǐng)日: 2017-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN106885858A
• 公開（公告）日: 2017-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方雷;阮錦滿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 方雷
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/72;G01N30/06;G01N30/14;G01N33/68
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬臨床醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種痕量臨床病人樣本的蛋白組學(xué)模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

2015年1月20日，時(shí)任美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬在國(guó)情咨文演講中提出了“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)(Precision Medicine)”計(jì)劃，旨在推動(dòng)個(gè)體化基因組學(xué)研究，依據(jù)個(gè)人基因信息為癌癥及其他疾病患者制定個(gè)體醫(yī)療方案。簡(jiǎn)單來說，“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”就是指根據(jù)每個(gè)病人的個(gè)人特征量體裁衣式地制定個(gè)性化治療方案。它是由“個(gè)性化醫(yī)療”聯(lián)合最新的遺傳檢測(cè)技術(shù)發(fā)展而來。遺傳檢測(cè)并不僅僅只是基因檢測(cè)，其范圍更廣，是對(duì)受檢者與相關(guān)微生物(如感染因子、共生微生物等)的遺傳物質(zhì)(包括DNA、RNA、染色體)及其產(chǎn)物(如蛋白質(zhì)、代謝物及小分子)進(jìn)行檢測(cè)，為疾病診療、健康管理提供信息與線索。目前已有的一些新型基因組學(xué)標(biāo)志物，包括全基因組DNA序列、全外顯子組DNA序列、表達(dá)譜、小RNA等，然而以蛋白質(zhì)作為疾病標(biāo)志物的仍然少之又少。究其原因，主要是臨床病人樣本在獲取時(shí)極其困難，樣本量又非常少，而蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)象蛋白質(zhì)又無法像基因組學(xué)研究的DNA、RNA那樣可以通過PCR得到擴(kuò)增，因此疾病蛋白標(biāo)志物的開發(fā)受到極大的限制。

腎小球腎炎是腎臟疾病的主要類型，是指腎小球固有細(xì)胞增殖和(或)白細(xì)胞浸潤(rùn)引起的以腎小球細(xì)胞成分增多為特征的一類疾病。根據(jù)發(fā)病機(jī)制和致病類型，腎小球腎炎分為5類：免疫復(fù)合物相關(guān)性腎小球腎炎、寡免疫復(fù)合物性腎小球腎炎、抗腎小球基膜腎炎、單克隆免疫球蛋白相關(guān)性腎小球腎炎和C3腎病。其中，免疫復(fù)合物相關(guān)性腎小球腎炎，是以特定類型的免疫復(fù)合物蛋白在腎小球的沉積為特征的一類疾病。目前在臨床上除了以免疫熒光結(jié)果(或不太常用的免疫組化結(jié)果)為基礎(chǔ)、并結(jié)合光鏡和電鏡結(jié)果進(jìn)行診斷分型外，尚未開發(fā)出靈敏、精準(zhǔn)和自動(dòng)化的診斷手段。近年來，美國(guó)的梅奧醫(yī)學(xué)中心(Mayo Clinic)等頂尖醫(yī)療機(jī)構(gòu)開始開發(fā)腎小球石蠟切片激光顯微切割結(jié)合質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)腎臟病病人腎小球的全蛋白組進(jìn)行檢測(cè)后用于臨床診斷和分型，獲得了較好結(jié)果。但是，受限于腎小球石蠟切片激光顯微切割獲取到的蛋白量，這一檢測(cè)方法一般采取非標(biāo)記蛋白質(zhì)譜定量方法進(jìn)行分析，只能檢測(cè)和定量到的幾十種不同的高豐度蛋白種類。另外，因?yàn)槭炃衅旧碇谱饕约皬闹刑崛〉鞍椎倪^程復(fù)雜，步驟繁瑣，造成樣品不同程度的損失和引入誤差，嚴(yán)重影響質(zhì)譜分析的結(jié)果和最終的疾病診斷。

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ)是由美國(guó)SCIEX公司研發(fā)的一種體外同種同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)。該技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較多達(dá)8組樣品之間的蛋白表達(dá)量，對(duì)數(shù)千個(gè)蛋白一次完成自動(dòng)定量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。然而，該技術(shù)對(duì)蛋白量的要求較高，一般每組樣品需要50μg以上的蛋白進(jìn)行標(biāo)記后混合，才能進(jìn)行下游的HPLC分級(jí)，從而實(shí)現(xiàn)10³數(shù)量級(jí)的蛋白定量。然而，多數(shù)情況下，臨床穿刺獲得的病人組織樣品量非常少，還要用于切片、染色等病理分析，只有極微量的組織可供蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。痕量的組織樣本，如激光顯微切割獲取腎小球，肉眼觀察不明顯，且不易進(jìn)行操作，又帶來一個(gè)總蛋白如何提取的新問題。因此，亟需針對(duì)此類痕量臨床病人樣本開發(fā)一整套從組織獲得、蛋白提取、蛋白酶解到蛋白質(zhì)質(zhì)譜高通量自動(dòng)定量分析的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明專利需要解決的問題是臨床病人組織樣本量少，蛋白提取效率低，蛋白量少且難以利用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行高通量、自動(dòng)化疾病標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)篩選的技術(shù)障礙。

本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到：1.將手術(shù)獲得或穿刺活檢獲得的臨床病人組織根據(jù)需要進(jìn)行激光顯微切割，獲取痕量的相同大小的組織。2.將痕量病人組織采用非接觸式超聲破碎高效提取總蛋白。3.將獲得的蛋白進(jìn)行還原烷基化，并進(jìn)行胰蛋白酶酶解。收集酶解肽段脫鹽后取微量肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)肽段數(shù)量對(duì)不同組蛋白的濃度完成相對(duì)定量。4.對(duì)不同組病人樣品按照流程進(jìn)行iTRAQ試劑的標(biāo)記，并真空抽干后進(jìn)行痕量樣品的HPLC預(yù)分級(jí)。5.將HPLC分級(jí)獲得的肽段提交到在線二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(2D-LC-MS/MS)進(jìn)行全蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。6.通過生物信息學(xué)工具分析，高通量高準(zhǔn)確度的篩選和確認(rèn)疾病標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)蛋白，真正通過質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)手段實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)疾病診斷。