[發(fā)明專利]基于CRISPR/Cas9多基因敲除低轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞系的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710153605.8
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN107151677B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏海濱;李雅;張偉鋒;朱久玲;李燕
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種基于CRISPR/Cas9多基因敲除低轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在目的基因的外顯子區(qū)域設(shè)計并合成相應(yīng)的sgRNA，室溫退火后連入載體pU6-sgRNA1.0，獲得sgRNA表達(dá)組件；

所述合成相應(yīng)的sgRNA為針對Ecm1外顯子6與Ecm1外顯子7以及針對Pgrn外顯子5與Pgrn外顯子6設(shè)計的sgRNA，其中：

針對Ecm1外顯子6的sgRNA序列為：ggatggcttc ccccctggg；

針對Ecm1外顯子7的sgRNA序列為：agctactgac cccctacaa；

針對Pgrn外顯子5的sgRNA序列為：cgtgctgtgt tatggtcga；

針對Pgrn外顯子6的sgRNA序列為：cggtgccttc tgcgacc；

2)將若干針對目的基因的一個或多個sgRNA表達(dá)組件進(jìn)行串聯(lián)，獲得多個sgRNA表達(dá)組件；

3)將兩個同向的loxP位點克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro載體，獲得pCDH-CMV-loxp-MCS-loxp-EF1α-Puro慢病毒載體；

4)將多個sgRNA表達(dá)組件與Cas9基因克隆至pCDH-CMV-loxp-MCS-loxp-EF1α-Puro慢病毒載體，獲得pCDH-CMV-loxp-Cas9-sgRNAs-loxp-EF1α-Puro質(zhì)粒，該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得的慢病毒命名為Lenti-Cas9-sgRNAs；

5)將Cre基因克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1α-Neo慢病毒載體，該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得的慢病毒命名為Lenti-Cre；

6)Lenti-Cas9-sgRNAs感染待打靶的細(xì)胞，感染后加1.0mg/mL的Puromycin篩選3～4天后，再用慢病毒Lenti-Cre感染篩選后的細(xì)胞，然后加入1.0mg/mL的新霉素篩選3～4天；

7)獲得的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，獲得目的基因敲除的單克隆細(xì)胞系。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的多個sgRNA表達(dá)組件分別是Ecm1與Pgrn的四個sgRNA表達(dá)組件進(jìn)行串聯(lián)。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟7)中所述的基因敲除的單克隆細(xì)胞系為乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。