[發明專利]基于CRISPR/Cas9多基因敲除低轉染效率細胞系的方法

有效

• 申請號: 201710153605.8
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN107151677B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 夏海濱;李雅;張偉鋒;朱久玲;李燕
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

本發明公開了一種基于慢病毒表達CRISPR/Cas9高效敲除低轉染率細胞的方法。該方法涉及兩種慢病毒，一種是表達sgRNA及Cas9的慢病毒，另一種是表達Cre蛋白的慢病毒。將多基因的sgRNA及Cas9同時克隆至慢病毒載體的兩個同向loxp之間，在低轉染效率的細胞內實現多基因同時敲除，再利用表達Cre的慢病毒，對基因組中整合的Cas9及sgRNA進行有效去除，防止過度表達Cas9及sgRNA造成脫靶效應。本發明結合了慢病毒具備的能夠高效感染分裂與非分裂細胞以及loxp?Cre系統高效去除反應的特點，該系統具有毒性小、基因敲除效率高、準確性高，周期短等特點，對于在低轉染效率的細胞系中實現多基因敲除意義重大。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及利用CRISPR/Cas9技術在低轉染效率細胞系中實現多基因同時敲除的技術及應用。具體涉及一種基于CRISPR/Cas9多基因敲除低轉染效率細胞系的方法。

背景技術

CRISPR/Cas9是細菌和古細菌長期演化形成的免疫防御系統，該系統是利用CRISPR-derivedRNA(crRNA)通過堿基配對與trans-activating RNA結合形成復合物，Cas9內切酶在此復合物引導下對與crRNA配對的序列進行定點切割。所以，通過人工設計具有引導作用的sgRNA(short guide RNA)，可以引導Cas9對宿主細胞DNA進行定點切割，然后通過非同源性末端接合(NHEJ)的機制進行修復，實現基因編輯。

目前，CRISPR/Cas9系統被成功應用于真核細胞基因敲除、基因組修飾、條件型knockout和knock-in。但是對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，磷酸鈣或脂質體轉染的方法難以成功將表達sgRNA與Cas9的質粒轉入細胞。由于慢病毒不僅能感染分裂或非分裂細胞，對于神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多類型細胞有極高的感染效率，并且慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上進行持久表達，所以利用慢病毒對較難轉染的細胞進行基因敲除具有廣闊的應用前景。但是利用慢病毒進行基因敲除時，sgRNA與Cas9隨機整合入基因組中并進行持久表達，當打靶完成后，過表達的sgRNA與Cas9容易造成脫靶效應。

Cre重組酶是1981年從P1噬菌體中發現的，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶由343個氨基酸組成，Cre重組酶不需借助任何輔助因子，可作用于線形、環狀或超螺旋DNA。Cre重組酶能夠特異性識別loxP位點，使兩個loxP位點間的基因序列被刪除或重組。所以利用Cre-loxp系統與慢病毒相結合的方式，構建sgRNA與Cas9介于兩個同向loxp之間的慢病毒，待打靶完成后，通過Cre-loxp系統將sgRNA與Cas9去除，從而有效地提高打靶效率，同時降低脫靶的風險。

發明內容

本發明的目的在于利用CRISPR/Cas9技術，提供一種基于CRISPR/Cas9多基因敲除低轉染效率細胞系的方法。

為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案：

一種基于CRISPR/Cas9多基因敲除低轉染效率細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在目的基因的外顯子區域設計并合成相應的sgRNA，室溫退火后連入載體pU6-sgRNA1.0，獲得sgRNA表達組件；

2)將若干針對目的基因的一個或多個sgRNA表達組件進行串聯，獲得多個sgRNA表達組件；

3)將兩個同向的loxP位點克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro載體，獲得pCDH-CMV-loxp-MCS-loxp-EF1α-Puro慢病毒載體；