[發明專利]一種多肽類熒光探針及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710152658.8
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN106929009B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 卿光焱;陸琦
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: C07K5/06
• 分類號: C07K5/06;C07K5/113;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

本發明涉及一種多肽類熒光探針，多肽類熒光探針是通過多肽的氨基與異硫氰酸熒光素的異硫氰酸基鍵合所得，多肽為四肽DAPD或者二肽，二肽為D、A及P這三種氨基酸中任意兩種氨基酸所形成的二肽。多肽類熒光探針的制備方法為：在反應容器中加入異硫氰酸熒光素，然后用甲醇或者水溶解，加入多肽，使異硫氰酸熒光素與多肽的摩爾比為1.2?1.5:1；恒溫20?40℃條件下，攪拌反應4?25h后，旋轉蒸發除去溶劑得粗產物；粗產物經高效液相色譜分離、純化和干燥后得到所需純產物。本發明從仿生的角度出發，制備出的熒光探針能夠快速而精確地識別唾液酸，對生物化學、材料學和醫學，尤其是一些以唾液酸為重要標示物的重大疾病的早期診斷與治療具有重要的理論和實際意義。

技術領域

本發明涉及生物化學技術領域，尤其涉及一種多肽類熒光探針及其制備方法與應用。

背景技術

唾液酸是一類含有羧基的九碳糖化合物酰基衍生物，其廣泛存在于細菌、魚類、哺乳動物等多種生物體內，它參與并調節許多重要的生命活動如細胞識別、生物膜流動和細胞內吞作用等。現如今科學家們發現的唾液酸成員已多達50多個，主要包括N-乙酰基神經氨酸、N-羥乙酰基神經氨酸和脫氨神經氨酸三種核心單體，其余的唾液酸均由這三種體衍生而來。由于唾液酸通常位于細胞膜的糖類部分和分泌的糖復合物(糖脂、糖蛋白和脂多糖)的關鍵位置，是糖復合物結構和功能多樣化的重要物質基礎，因此對于血液中唾液酸的分析和檢測通常是一些重大疾病早期診斷和治療的關鍵。例如多聚脫氨神經氨酸被視為肺癌腫瘤的重要標示物之一。目前唾液酸的檢測和分析主要依賴于熒光輔助的高效液相和質譜方法的聯用，但是由于唾液酸所處環境中其他糖類的干擾，這一檢測方法的準確度并不令人十分滿意。另外由于唾液酸種類繁多，且相互之間差異極小，因此對于單一唾液酸的有效檢測仍舊是一大難題。綜上所述，開發對血液中低濃度的唾液酸具有高靈敏度和高特異性的檢測手段，對于進一步研究人體某些重大疾病的致病機理以及相關疾病早期生物標示物的發現具有重要意義。

發明內容

本發明旨在提供一種多肽類熒光探針及其制備方法與應用。該多肽類熒光探針可在類比于血液中低濃度條件下將唾液酸與其他中性單糖區分開來，或者組合利用該熒光探針可以進一步確定唾液酸的種類。

本發明目的采用下述方案來實現：

一種多肽類熒光探針，所述多肽類熒光探針的結構式如下：

所述多肽類熒光探針是通過多肽的氨基與異硫氰酸熒光素的異硫氰酸基鍵合所得，所述多肽為四肽DAPD或者二肽，所述二肽為D、A、P這三種氨基酸中任意兩種氨基酸所形成的二肽。這些肽段均由不同氨基酸通過固相反應合成。

上述方案中，所述二肽為PD、DP、DA、DD、PA或AD。

上述方案中，包括以下步驟：在反應容器中加入異硫氰酸熒光素，然后用甲醇或者水溶解，加入多肽，使異硫氰酸熒光素與多肽的摩爾比為1.2-1.5:1；恒溫20-40℃條件下，攪拌反應4-25h后，旋轉蒸發除去溶劑得粗產物；粗產物經高效液相色譜分離、純化和干燥后得到所需純產物。

所述的多肽類熒光探針在識別唾液酸中的應用。

上述方案中，包括以下步驟：

1)先配置濃度為2.0-20μM的DAPD熒光探針水溶液，在激發波長470nm條件下測其發射的熒光光譜，記錄其500-550nm處的熒光強度I₀；

2)往該溶液中加入單糖并混合均勻，所述單糖與所述DAPD熒光探針的摩爾比為0.1-10，在激發波長470nm條件下測其發射的熒光光譜，記錄其在500-550nm處的熒光強度I₁；

3)往步驟2)所得的溶液中繼續加入單糖并混合均勻，在激發波長470nm條件下測其發射的熒光光譜，記錄其在500-550nm處的熒光強度I₂；