[發明專利]真核表達制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的基因及方法

在審

• 申請號: 201710150095.9
• 申請日: 2017-03-14
• 公開（公告）號: CN106929514A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 王秀利;孫鶴;李慧;孔德榮;劉海映;仇雪梅
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12N15/26
• 分類號: C12N15/26;C07K14/55;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 大連非凡專利事務所21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種可高效表達且表達產物具有明顯生物學活性的真核表達制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的基因及方法。

背景技術

紅鰭東方鲀是國內養殖出口魚類的主要品種。但在養殖中經常會有白嘴病、真鯛虹彩病毒病等病毒性疾病以及弧菌病、鏈球菌病等細菌性疾病發生，降低了成魚產量，進而增加了養殖成本。因此，如在紅鰭東方鲀養殖過程中提高魚體自身免疫機能既可以保證魚體食用安全性，又可避免化學藥物對環境造成的污染。

細胞因子是魚類免疫系統中的重要成員，行使特異性和非特異性的免疫防御，能夠調節細胞的分化并誘導細胞發揮相應的功能，白介素2（interleukins-2,IL-2）是一類能夠在免疫細胞和白細胞之間相互作用的細胞因子，主要由活化的Ｔ淋巴細胞分泌。研究表明IL-2與含有α，β，γ三條鏈的復雜受體IL-2R結合后觸發胞內信號反應，從而在Ｔ淋巴細胞、Ｂ淋巴細胞和自然殺傷細胞的復制與分化過程中發揮重要作用。2001年開始，魚類白介素2的研究廣泛展開，徐炳森等從草魚頭腎淋巴細胞中提取RNA并反轉錄為cDNA，以高等動物和牙鲆的IL-2基因兩端的保守序列為依據設計合成引物，以cDNA為模板進行PCR擴增，并將其克隆入PET-28載體后在大腸桿菌中進行表達。2002年第一條草魚IL-2基因登陸Genebank數據庫和2005年成功克隆日本河豚IL-2基因更加堅定了人類探索魚類IL-2基因的信心。至2014年，草魚、鱒、綠河豚、紅鰭東方鲀、三刺魚、虹鱒、鱸魚等白介素2基因序列均已登陸Genebank，且其中已有部分被成功克隆，但是紅鰭東方鲀白介素2基因在真核細胞中表達的研究還未有報道。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的技術問題，提供一種真核表達制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的基因及方法。

本發明的技術解決方案是：一種真核表達制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的基因，其特征在于所述基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

一種真核表達制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的方法，其特征在于依次按照如下步驟進行：

a. 將DNA序列如SEQ ID NO:1所示的基因克隆入真核表達質粒pPICZαA上，得到真核表達重組質粒pPICZαA-IL-2；

b. 將得到的真核表達重組質粒pPICZαA-IL-2電轉化入畢赤酵母GS115感受態中，篩選陽性克隆；

c. 將篩選出的陽性克隆接種到BMGY液體培養基內擴大培養至OD_600nm=2~6，離心收集菌體；

d. 用無菌水重懸所收集的菌體，使OD_600nm=1.0~2.0，離心后收集菌體； BMMY液體培養基重懸菌體后轉接至100mL含BMMY液體培養基的錐形瓶中，使OD_600nm=1.0~2.0；28~30℃、250~300 rpm震蕩培養96h，期間每24h向培養基中添加甲醇至終濃度為1.5%；12000rpm，4℃離心3min收集上清，PBS緩沖液透析，3KD超濾管濃縮，75%硫酸銨沉淀法再次濃縮上清中的蛋白，收集沉淀，即得重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白。

本發明是在天然紅鰭東方鲀白介素2基因的基礎上進行密碼子優化，并在序列兩端加入酶切位點等，繼而以改造的基因真核表達制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白，與現有技術相比，具有如下優點：（1）能夠在畢赤酵母中高效表達，表達量占菌體總蛋白的80%以上；（2）所表達的重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白主要分泌到畢赤酵母細胞外的培養基中，不需要超聲破碎等繁瑣操作就可以得到重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白，且其穩定性好，可重復性高，適用于大規模工業化生產。

附圖說明

圖1是本發明實施例重組質粒的雙酶切電泳鑒定圖。

圖2是本發明實施例不同甲醇濃度所誘導的重組蛋白表達的電泳圖。

圖3是CTLL-2細胞在紅鰭東方鲀白介素2標準品作用下的增值曲線圖。

圖4是 CTLL-2細胞在本發明實施例重組蛋白作用下的增值曲線圖。

具體實施方式

本發明是在天然紅鰭東方鲀白介素2基因的基礎上針對畢赤酵母密碼子的偏愛性進行密碼子優化，并在序列N端添加XhoⅠ及kex 2蛋白酶切位點，C端保留終止密碼子并添加XbaⅠ酶切位點。優化的基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示，用于真核表達制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白。