[發明專利]維生素B12的液相色譜?電感耦合等離子體質譜聯用檢測方法

在審

• 申請號: 201710149802.2
• 申請日: 2017-03-14
• 公開（公告）號: CN106950300A
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: 劉杰;范志勇;張莉;彭青枝;文紅;王會霞;周陶鴻;朱曉玲;龔蕾
• 申請（專利權）人: 湖北省食品質量安全監督檢驗研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 倪婭,陳衛

技術領域

本發明涉及成分檢測技術領域，具體地指一種維生素B₁₂的液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測方法。

背景技術

維生素B₁₂又稱鈷胺素或氰鈷素，是一種由含鈷的卟啉類化合物組成的B族維生素。維生素B₁₂的檢測至今是國際上食品分析的難題之一，首先是動物食品中的維生素B₁₂有氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲基鈷胺等多種結構形式，傳統的分析方法很難反映其實際含量；其次維生素B₁₂在食品中的含量低，為10^-9級，通常食品含量在0.4～3μg/100g；另外，維生素B₁₂主要以維生素B₁₂-內因子復合物的形式存在，充分提取和分離難度很大，樣品中其他色譜行為與維生素B₁₂相近的水溶性維生素也會對它的分離檢測造成很大干擾。

目前，維生素B₁₂的測定標準方法涉及微生物法(GB5413.14-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素B₁₂的測定)、高效液相色譜法(GB/T 5009.217-2008保健食品中微生物B₁₂的測定)、液相色譜法-串聯質譜法(SN/T 4258-2015出口食品中水溶性維生素的測定方法第二部分)，尚無HPLC-ICP/MS的方法。以往的研究表明，分光光度法成本低、靈敏度也低；微生物法檢出限低，但步驟繁瑣、費時費力、易受污染且準確度不高；原子吸收光譜法適用于測定總鈷；HPLC方法檢出限較高，只適用于維生素B₁₂含量較高的保健品的測定；高效毛細管電泳法靈敏性低，但可以測定不同形態，目前主要應用于基礎和理論研究之中；LC-MS/MS靈敏度高，準確性好，檢出限低，但是基質干擾較為嚴重。

綜上所述，由于食品中維生素B₁₂含量難以檢測，而使用其他方法存在提取不充分和準確度不高等問題。由此可見，目前尚未有一種試樣處理簡單又快速準確測定食品中維生素B₁₂含量的方法產生。

發明內容

本發明的目的就是要克服現有技術靈敏度不高、檢出限高、基質干擾嚴重的缺陷，提供一種靈敏度高、檢出限低、準確性好且操作便捷的維生素B₁₂的液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測方法。

為實現上述目的，本發明所設計的維生素B₁₂的液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測方法，其步驟如下：

(1)將含有維生素B₁₂的原料經過前處理后溶解定容，或將原料中的鈷胺素經過預處理得到性質穩定的氰鈷胺后溶解定容，得到待凈化液；

(2)將待凈化液通過已活化的固相萃取柱，以低濃度的乙腈溶液洗去干擾物質，再以高濃度的乙腈溶液將維生素B₁₂洗脫，收集全部洗脫液，根據含量稀釋洗脫液，微孔濾膜后，得到待測液，待檢測分析；

(3)進行維生素B₁₂的HPLC-ICP/MS檢測，所述液相色譜中選用的色譜柱為C₁₈色譜柱。

優選地，上述方法中，所述原料的取用量精確至0.01g。

優選地，上述方法中，所述步驟(2)中低濃度的乙腈溶液的濃度為5～10％v/v；高濃度的乙腈溶液的濃度為20～40％v/v。

優選地，上述方法中，所述C₁₈色譜柱，液相條件：流動相為A：5～10mmol乙酸銨：B甲醇＝81:19，等度洗脫，0.4mL/min；柱溫24℃；進樣量20μL。

優選地，上述方法中，電感耦合等離子體質譜儀的使用參數為：冷卻氣流速：14.0L/min；輔助氣流速：0.8L/min；霧化器流速：1.05L/min；碰撞氣流速：4.8mL/min；采樣錐孔徑：1.1mm；截取錐孔徑：0.5mm；霧室溫度：2℃；功率：1550W。

本方法具有較低檢測下限，可以達到0.02μg/kg，如果MS的測量條件由KED模式改為STD模式，該方法的檢測下限還可以提高3～5倍。而HPLC-MS/MS法的檢出限為0.5μg/kg。