[發明專利]創新霉素生物合成基因簇及其應用

有效

• 申請號: 201710146841.7
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN106754986B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 卞小瑩;張友明;許曉坤
• 申請（專利權）人: 山東大學蘇州研究院;山東大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12P17/18
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一種創新霉素的生物合成基因簇，該基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，命名為cxm；其包含編碼創新霉素生物合成所涉及的10個基因，其中7個是與生物合成相關基因，1個是調控基因，1個抗性基因，1個是轉運基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2～SEQ ID No.11所示。所述基因功能通過異源表達結合基因同框刪除試驗驗證。本發明還公開了所述基因簇或其表達的編碼蛋白在催化合成創新霉素或其類似物中的應用，實現了創新霉素的生物合成。本發明所提供的基因及其蛋白也可以用來尋找和發現可用于醫藥、工業或農業的化合物或基因、蛋白。

技術領域

本發明屬于微生物基因資源和基因工程領域，具體地，涉及一種創新霉素生物合成基因簇、包含其的載體、宿主及其應用。

背景技術

創新霉素(chuangxinmycin，CXM)與色氨酸(tryptophan)有結構上的相似性(見式(I))，是一種高效的細菌色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)的選擇性抑制劑。

比如創新霉素對大腸桿菌的TrpRS的IC50為30nM，但是其在30μM濃度下對綿羊的TrpRS沒有抑制作用，顯示了創新霉素是一種特異性的抑制劑(Brown et al,2002)。最近的研究表明色氨酰tRNA合成酶抑制劑(吲哚霉素和創新霉素)能夠擾亂與氯霉素、紅霉素和萬古霉素抗性相關的富含色氨酸的蛋白的生物合成，從而減弱細菌對氯霉素、紅霉素和萬古霉素的抗性，因此色氨酰tRNA合成酶抑制劑與另外的抗生素聯用可以降低細菌的多重抗藥性。創新霉素是中國發現的第一個全新結構的新抗生素，由濟南游動放線菌(Actinoplanestsinanensis)產生，其分子的主核為罕見的吲哚并噻喃三環結構，這在化學上是一個新的含硫的雜環體系。最初報道該抗生素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和痢疾志賀菌有較強的抗菌活性，并對感染了痢疾志賀菌和大腸桿菌的小鼠模型顯示出體內抗菌活性。初步臨床試驗表明它對于大腸桿菌引起的敗血癥、膽囊炎和尿路感染有顯著的療效(有效率達77.86％)。體外和體內的聯合抗菌實驗表明，創新霉素與慶大霉素、新霉素、巴龍霉素、卡那霉素B、多黏霉素、氨芐青霉素、青霉素和頭孢菌素I等8種抗生素有不同程度的協同作用，提高創新霉素抗菌作用4～32倍，有可能提高臨床療效，防止或延緩耐藥性的產生。但是由于其發酵單位太低導致生產成本高，抗菌譜較窄，僅能口服，且抗菌活性低于目前臨床上其他抗菌藥物，致使其仍未廣泛用于臨床。

關于創新霉素的生物合成機理及其相關重要的酶學研究還沒有得到驗證。從化學結構上來說，創新霉素屬于吲哚類生物堿，很有可能是利用色氨酸作為起始單元進行生物合成的，但是它的具體的生物合成途徑依然未知。我國學者曾對創新霉素的生物合成進行了初步的研究，利用同位素標記的方法發現創新霉素分子中噻喃環的硫直接來自半胱氨酸的巰基，應用標記甲基供體S-腺苷-L-[甲基-¹⁴C]甲硫氨酸(SAM)測定創新霉素產生菌無細胞提取物對吲哚丙酮酸的甲基化作用，發現創新霉素產生菌中存在吲哚丙酮酸碳甲基轉移酶(indolepyruvate C-methyltransferase)可能負責C-2的甲基化，其分子量是55000±5000道爾頓。經對現有技術的文獻檢索，尚未發現有關創新霉素生物合成基因簇、包含其的載體及宿主和利用基因表達編碼蛋白用于催化合成抗生素創新霉素或其類似物應用的報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種創新霉素的生物合成基因簇、包含其的載體、宿主及其應用。利用本發明的基因簇可實施發酵生產創新霉素，實現創新霉素的生物合成。

本發明所述的創新霉素的生物合成基因簇，其特征在于，該基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，命名為cxm；其包含編碼創新霉素生物合成所涉及的10個基因，其中7個是與生物合成相關基因，1個是調控基因，1個抗性基因，1個是轉運基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2～SEQ ID No.11所示，具體是：