[發明專利]一種用于結核分枝桿菌感染檢測的試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201710145841.5
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN107058517B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 崔俊偉;張邊防;高漸聯;周愛杰;李振云
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 潘宏偉

本發明公開了一種用于結核分枝桿菌感染檢測的試劑盒，包括如下部分：由檢測引物、10倍環介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照、顯色劑和菌體擴培液組成；所述的檢測引物是由一對外引物F3/B3和一對內引物FIP/BIP組成。該試劑盒能夠高效、快速、準確、靈敏的得到血液中結核分枝桿菌感染的檢測結果，且檢測結果特異性高、敏感性強，結果判斷不需要使用電泳、眼易判斷，非常適用于結核分枝桿菌的快速檢測。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種用于結核分枝桿菌感染檢測的試劑盒及檢測方法。

背景技術

由人結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)所引起的結核病是嚴重危害人類健康的傳染病。近幾十年來由于人口流動，耐藥結核菌傳播，已成為所有傳染病中的重要原因。如果得不到有效控制，在未來可能有更多的人發生結核病。

新型免疫學方法中的γ-干擾素(IFN-γ)釋放實驗(interferon-gammareleaseassay，IGRA)是現階段檢測結核分枝桿菌感染準確性較高的方法，現有的商用試劑盒有T-SPOT.TB和QuantiFERON-TBGoldIn-Tube(QFT-IT)，這兩個試劑盒的敏感性和特異性分別為80-90％之間，尚有待改進。

環介導等溫基因擴增(LAMP)是新型的基因擴增法，具有以下特點：簡便、快速、不需要昂貴的儀器設備，適合現場使用，不需要對模板進行熱變性過程，退火和延伸在同一溫度(等溫)條件下進行，大大減少了反應時間，能在短時間內獲得結果。LAMP的靈敏度高，能從極低微量的拷貝中擴增出目的基因，擴增效率高達10⁹-10¹⁰拷貝，比傳統PCR技術高出2-3個數量級，具有與Real-Time TaqManPCR同樣的敏感性。

然而，目前的大多數結核分枝桿菌的檢測樣品針對的是痰標本，痰標本取樣多為病人自取，人為誤差容易造成標本感染，影響檢測的準確率。又因為結核病感染初期，血液中的結核分枝桿菌難以被精確的檢測出，容易造成診斷不及時，影響結核病患者的診斷和有效治療。所以，有必要開發一種依賴于LAMP技術、準確、快速檢測結核分枝桿菌的新型試劑盒。

發明內容

本發明提供的一種用于結核分枝桿菌感染檢測的試劑盒及檢測方法，該試劑盒能夠高效、快速、準確、靈敏的得到血液中結核分枝桿菌感染的檢測結果，且檢測結果特異性高、敏感性強。

本發明的目的是提供一種用于結核分枝桿菌感染檢測的試劑盒，包括如下部分：

由檢測引物、10倍環介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照、顯色劑和菌體擴培液組成；所述的檢測引物是由一對外引物F3/B3和一對內引物FIP/BIP組成，

外引物F3的序列為：5’-CTGGGCCTCAAGCAAGG-3’

外引物B3的序列為：5’-CGACGTCGCTGACCACTT-3’

內引物FIP的序列為：

5’-CGGGCGACGGTTTCGAAGTCGGAAGACGGGGTCAACGGT-3’

內引物BIP的序列為：

5’-CGGCTGCAAGAGATGGCGTCTTGGGTCACCCTCTCGT-3’

其中，所述的一對外引物F3/B3與一對內引物FIP/BIP的摩爾數之比為1：6；所述的DNA聚合酶為BstDNA聚合酶，活力為8U/微升；所述的陰性對照為滅菌雙蒸水；

每升所述菌體擴培液由以下組分制成：5-10g的葡萄糖、5-10g的雞蛋清、6.7μmol的EDTA、100mL的甘油、30mmoL的二硫蘇糖醇、8-12g的PEG-4000，余量為雙蒸水；