[發明專利]KARS基因點突變小鼠模型的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201710144200.8
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN106929533B
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 汪錫金;楊濤;余力加;何龍霞;宋珺;王西樵
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬新華醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提供KARS基因點突變小鼠模型的構建方法及其應用，KARS基因點突變小鼠模型的構建方法包括如下步驟：步驟一：靶點構建，尋找與神經系統疾病相應的基因，并進行靶點設計；步驟二：設計Guide?RNA/Cas9mRNA，并且制備成質粒，轉錄后顯微注射到受精卵細胞質中；步驟三：Founder小鼠鑒定；步驟四：F1代小鼠鑒定。本發明的構建具有神經系統疾病的小鼠模型的方法及其應用，由于針對KARS基因的定點突變來進行，使得模型小鼠的疾病研究能夠在與真實疾病的發生和發展更加接近的條件下進行，其研究的結果更具參考價值。

技術領域

本發明涉及一種KARS基因點突變小鼠模型的構建方法，本發明還涉及KARS基因點突變小鼠模型的應用，屬于動物模型領域。

背景技術

認知是機體認識和獲取知識的智能加工過程，涉及學習、記憶、語言、思維、精神、情感等一系列隨意、心理和社會行為。認知障礙指與上述學習記憶以及思維判斷有關的大腦高級智能加工過程出現異常，從而引起嚴重學習、記憶障礙，同時伴有失語或失用或失認或失行等改變的病理過程。

目前，認知障礙的小鼠模型主要采用血管性癡呆和阿爾茲海默病兩種類型。血管性癡呆由于急慢性腦缺血缺氧，引起腦組織損傷，可導致腦功能減退，認知功能下降。其中，針對大動脈的主要模型構建方法有血管阻斷法和血管栓塞法，微小血管損傷的模型有易卒中自發性高血壓大鼠(SHRSP)，伴皮質下梗死和白質腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病CADASIL動物模型(Notch3轉基因鼠)等。阿爾茲海默病的模型常見的有：①通過局部毀損動物大腦膽堿能系統導致其記憶和認知功能障礙；②腦內注射β淀粉樣蛋白局部模擬AD；③轉基因動物模型如APP轉基因模型、PS轉基因模型、tau轉基因模型等。然而，上述的動物模型并不十分成熟，用手術方式構建模型對動物打擊較大，術中死亡率較高，術后也難以長期存活，不利于觀察研究。AD的轉基因模型僅能代表某些病理、生理，也很難充分再現阿爾茲海默病的復雜特性。如何找到一種更貼近自然發生方式的動物模型的構建方法，是當前對認知障礙進行研究亟待解決的問題。

發明內容

我們的研究發現，KARS基因的異常突變與認知障礙有關。構建KARS基因突變小鼠模型，可以幫助研究者深入了解KARS的其他生物學功能，為探索KARS功能與認知障礙的相關性提供有效的研究途徑和方法，并由此提供其應用。通過CRISPR/Cas9方法構建一種新型的、穩定性高、重復性好的KARS基因突變小鼠模型，有望深入研究疾病的損傷機制，從而找到延緩認知障礙發生發展的新方法。

本發明的目的在于提供一種KARS基因點突變小鼠模型的構建方法以及KARS基因點突變小鼠模型的應用。

本發明采用了如下技術方案：

一種構建具有神經系統疾病的小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：靶點構建

1)尋找KARS基因的CDS區，明確外顯子部分，點位：R504H；

2)靶點設計；

步驟二：獲取受精卵，并進行顯微注射；

1)Guide-RNA，Cas9RNA轉錄；

2)純化轉錄產物；

3)將Guide-RNA/Cas9 mRNA顯微注射到受精卵細胞質中；

步驟三：將受注射過Guide-RNA/Cas9 mRNA的受精卵進行培養，然后進行胚胎移植；

步驟四：Founder小鼠鑒定：

提取出生的胚胎移植小鼠的DNA，進行PCR鑒定；

步驟五：F1代小鼠鑒定，將Founder小鼠與野生型小鼠交配，生出的小鼠為F1代，若F1代中有陽性小鼠出生，表明相關品系小鼠模型構建成功。