[發明專利]KARS基因點突變小鼠模型的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201710144200.8
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN106929533B
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 汪錫金;楊濤;余力加;何龍霞;宋珺;王西樵
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬新華醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種KARS基因點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：靶點構建

1)尋找KARS基因的CDS區，明確外顯子部分，點位：R504H，KARS基因Gene Bank GeneID:85305，

2)靶點設計；

步驟二：獲取受精卵，并進行顯微注射

1)Guide-RNA，Cas9RNA轉錄，

2)純化轉錄產物，

3)將Guide-RNA/Cas9 mRNA顯微注射到受精卵細胞質中；

步驟三：將受注射過Guide-RNA/Cas9 mRNA的受精卵進行培養，然后進行胚胎移植；

步驟四：Founder小鼠鑒定

提取出生的胚胎移植小鼠的DNA，進行PCR鑒定；

步驟五：F1代小鼠鑒定

將Founder小鼠與野生型小鼠交配，生出的小鼠為F1代，若F1代中有陽性小鼠出生，表明相關小鼠模型構建成功；

步驟六：P532S位點突變的小鼠的建立；

步驟七：KARS R504H/P532S雙位點復合雜合突變，

將R504H純合子突變小鼠與P532S純合子突變小鼠雜交，得到雜合突變小鼠。

2.如權利要求1所述的KARS基因點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于，其中，

與KARS基因的點位R504H相對應的sgRNA的DNA序列是：

ccccagGCACCGCTCCAAAGAGG，

將野生型基因中CGC突變為CAC的模板DNA是：KARS-R504H-120bp-oligo:ggtattgcattatgagagctctgaatattcatcctctgtggtctcgcgtccccagGCACCACTCCAAAGAGGGTCTCACGGAGCGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCA，其中下劃線部分的三個堿基為突變位點。

3.如權利要求1所述的KARS基因點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于，其中，

對Founder小鼠進行鑒定所用的鑒定引物是：

KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA；

KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。

4.如權利要求1所述的KARS基因點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于：

其中，P532S的sgRNA的DNA序列為：KARS-P532S-sgRNA-S:CTGAGCTGAATGACCCCGTGCGG，

和/或

KARS-P532S-sgRNA-2S：ACAGCTGCCTCTGCCGCACGGGG，

將野生型基因中CGC突變為CAC的模板DNA是

KARS-P532S-120bp-oligo:

CGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCAATGCCTATACTGAGCTGAATGACTCCGTGCGGCAGAGGCAGCTGTTTGAGGAGCAGGCCAAGgtgagtgagtgagtgagacta，其中下劃線部分的三個堿基為突變位點。

5.如權利要求4所述的KARS基因點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于：

對P532S位點突變的小鼠進行鑒定的鑒定引物是：

KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA，

KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。