[發明專利]一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法

在審

• 申請號: 201710142455.0
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN106916866A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 黃運紅
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12R1/625
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙)61223
• 代理人: 潘宏偉

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體為一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法。

背景技術

博來霉素為廣譜抗腫瘤藥，對鱗癌，包括頭頸部、皮膚、食道、肺、宮頸、陰莖和甲狀腺等癌腫以及惡性淋巴瘤等有效，對腦瘤、惡性黑色素瘤和纖維肉瘤等也具有一定療效。博來霉素有獨特的分子結構和生物活性，能夠介導激活氧分子，并選擇性的引起單鏈和雙鏈DNA的斷裂從而抑制腫瘤細胞的DNA合成和復制。此外，博來霉素還可以選擇性的裂解RNA從而抑制蛋白質的合成。博來霉素的活性機理決定了其不會抑制骨髓造血系統和免疫系統，因此對人體白細胞，機體免疫功能和造血系統等的副作用較為輕微。博來霉素屬于細胞周期非特異性藥物，從上世紀80年代其被開發成一種重要的有效抗腫瘤藥物，在臨床上廣泛應用。目前博來霉素一般與其他抗腫瘤藥物或輔助藥物聯合應用，以降低其毒性和獲得更好的抗腫瘤效果。

博來霉素自被發現后便因其強效的抗腫瘤活性迅速成為治療多種腫瘤的特效化療藥物，近年來博來霉素族抗生素在抗病毒研究中的應用，更加拓寬了其應用范圍。但是博來霉素導致的劑量依賴性肺纖維化以及一些腫瘤細胞逐漸形成的耐藥性極大的限制了其臨床應用和推廣。因此，合成新型的高效低毒的博來霉素族衍生物一直都是開發博來霉素類抗腫瘤藥物的關鍵和熱點。雖然博來霉素的化學合成已經完成，但是通過傳統化學修飾獲取少量的博來霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同時博來霉素及其復雜的分子結構也導致相關的合成過程繁瑣且效率低下，無法滿足臨床研究的需要和工業化生產的應用。為此，我們提出了一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法投入使用，以解決上述問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，以解決上述背景技術中提出的通過傳統化學修飾獲取少量的博來霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同時博來霉素及其復雜的分子結構也導致相關的合成過程繁瑣且效率低下，無法滿足臨床研究的需要和工業化生產的應用的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法，該博來霉素族衍生物的微生物發酵制備方法的具體步驟如下：

S1：在輪枝鏈霉菌菌種的新鮮斜面加入10ml無菌水，刮下白色孢子層后，所得的懸浮液經過濾后振蕩2min，制得單孢子溶液；

S2：利用滴定管吸取10ml單孢子溶液于無菌平板中，采用紫外線照射后，將其均勻涂布于無菌平板中培養，制備出耐性菌株；

S3：將耐性菌株接種至含有發酵培養基的三角瓶中，搖瓶發酵；

S4：將發酵后產生的發酵液經過過濾后用微量注射器各取上清液15μL，并滴于圓形層析濾紙小片上，且紙片貼在鑒定菌的培養板上，在37℃環境下培養14～20h，并取抑菌圈較大者進行復篩；

S5：利用HPLC色譜分析方法選取目標產物生產能力較高的菌株，并轉接于發酵培養基中，裝液量為50mL的三角瓶，在30℃、170r·min^-1的條件下搖床培養60～70h，得到作為發酵培養的種子液；

S6：以10％接種量將所得種子液接種到發酵培養基中進行搖床培養，發酵體系為300mL三角瓶裝液量為50mL，在30℃、200r·min^-1的條件下搖床培養6d；

S7：發酵結束后，收集發酵液，用10倍體積甲醇振蕩浸提24h后，將甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干后既得。

優選的，所述步驟S2中，在采用紫外線照射時，紫外線發光光源為30W，260A，紫外線光源的照射距離為30cm。

優選的，所述步驟S3中，發酵培養基為淀粉、糊精、大豆粉、葡萄糖、玉米漿、黃豆粉、酵母粉、硫酸銅和硫酸鋅的混合物，其PH值為6.5～7.0。

優選的，所述步驟S4中，鑒定菌為枯草桿菌。

優選的，所述步驟S5中，在采用HPLC定量分析中，液相色譜條件為色譜柱YWG，C₁₈，10μm，250×4.6mm。

優選的，所述步驟S7中，真空干燥箱的功率為3～5KW，烘干溫度為90～110℃。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明提高了博來霉素的生產周期，進一步的提高其產量，并簡化了發酵培養基的成分，降低了生產成本，且制備出的博來霉素能夠展現出更好的活性和更低的毒性。

附圖說明

圖1為本發明制備流程圖。

具體實施方式