[發明專利]探針法qPCR進行獅物種特異性鑒定的方法

在審

• 申請號: 201710141318.5
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN108570493A
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發明（設計）人: 張宇;白素英;金煜;王震
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種探針法qPCR鑒定獅物種特異性的檢測方法，包括獅上游引物：5’—CCCGCCAATCCTCTAAGCA—3’；獅下游引物：5’—GGAATAGATCGGAGGATTGCAT—3’；獅探針：5’—(VIC)TCCCCATATCAAACC(MGB)—3’；檢測方法：提取樣品DNA；對樣品DNA進行qPCR擴增；對擴增曲線分析后判定結果。通過特異性實驗、靈敏度實驗、重復性實驗和盲測試驗表明，本發明特異性好、靈敏度高、準確性好，克服了傳統測序檢測方法的許多缺點，可以對獅制品的真偽進行快速、準確、特異地鑒定，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種基于MGB探針的qPCR法進行獅物種特異性鑒定的方法，涉及分子生物學領域。本發明檢測方法特異性好、靈敏度高、重復性好。

背景技術

獅(Panthera leo)，現存亞洲獅和非洲獅2個亞種。目前亞洲獅被列入CITES附錄I，非洲獅則被列入附錄II。在中國，獅沒有野外分布，但動物園有大量飼養。獅是常用來偽造其他動物制品的造假材料，如獅骨假冒虎骨等。目前，國際禁止獅及相關制品的貿易，但是在經濟利益的刺激下，獅制品的非法貿易時有發生。所以，迫切需要一種高效、準確識別獅制品真偽的檢測方法。

傳統的獅制品分子檢測手段，一般是首先提取獅制品中的DNA，再利用引物擴增目的片段，最后通過測序比對的方法來鑒定獅制品的真偽。由于大多數獅制品中DNA降解和片段化較為嚴重，經常難以提取出有效的DNA、擴增出滿足測序分析的長序列。與此同時，隨著現代造假技術的發展，傳統的形態學鑒定也難以解決。

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一種在DNA聚合酶鏈式反應(PCR)中，以熒光化學物質檢測每次擴增循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中特定DNA序列進行定性定量分析。該方法通過熒光信號的分析，對PCR進程進行實時檢測。探針法是qPCR中一種常見方法，在反應體系中加入化學修飾的寡聚核苷酸探針。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，無法檢測到熒光信號。而當PCR擴增時，Taq酶的5’-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，熒光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結構被破壞，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。MGB探針是在傳統Taqman水解探針基礎上的改進，通過在探針的3’端加入MGB基團，從而提高探針的退火溫度，縮短探針的長度，提高探針的特異性和靈敏度。

本發明建立了一種對疑似獅制品的獅物種特異性的實時熒光定量PCR檢測方法，利用MGB探針，能夠高效、準確和更快速的檢測疑似獅制品是否特異地來源于獅。Cytb基因是目前國內外廣泛認可的用于物種鑒別的DNA序列，本發明針對Cytb基因設計引物和MGB探針。

發明內容

本發明的第一個目的是設計針對獅的特異引物和探針。

本發明的第二個目的是為了克服現有分子生物學檢測技術的不足之處，建立一種使用方便、快捷、準確的獅制品真偽識別的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明采用以下方案：

1、DNA的提取體系