[發明專利]探針法qPCR進行獅物種特異性鑒定的方法

在審

• 申請號: 201710141318.5
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN108570493A
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發明（設計）人: 張宇;白素英;金煜;王震
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用MGB探針法qPCR進行獅物種特異性鑒定的方法，其特征在于包括特異性引物和探針的序列如下：

獅上游引物 5’—CCCGCCAATCCTCTAAGCA—3’

獅下游引物 5’—GGAATAGATCGGAGGATTGCAT—3’

獅探針 5’—(VIC)TCCCCATATCAAACC(MGB)—3’。

2.根據權利1所述的利用MGB探針法qPCR進行獅物種特異性鑒定的方法，其特征在于構建20μl單熒光反應體系由以下組分組成：

3.一種采用如權利1、權利2所述的利用MGB探針法qPCR進行獅物種特異性鑒定的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、提取樣品DNA

B、對步驟A中的樣品DNA進行qPCR擴增，其中反應體系由以下組分組成：

所述的引物和探針：

獅上游引物 5’—CCCGCCAATCCTCTAAGCA—3’

獅下游引物 5’—GGAATAGATCGGAGGATTGCAT—3’

獅探針 5’—(VIC)TCCCCATATCAAACC(MGB)—3’

C、對擴增后的曲線情況進行結果判定，按照以下判定原則：

Ct值小于等于30并有明顯擴增曲線判為陽性；Ct值大于等于35判為陰性；Ct值介于30～35之間判為可疑，重復實驗，如果實驗結果相同且擁有明顯擴增曲線判為陽性，否則判為陰性。

4.根據權利3所述的檢測方法，其特征在于步驟B和步驟D所述的qPCR擴增按照以下步驟進行：94℃2min；94℃10s，60℃30s 40個循環；60℃1min，循環在退火時收集熒光信號。

5.根據權利3所述的檢測方法，其特征在于步驟A所述的樣品DNA提取按照以下步驟進行：

取疑似獅子制品20mg放置于2ml離心管中，加入350μl PBS和0.9μl RNase A，用剪刀溫和的剪碎組織30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶K，立即渦旋振蕩1min混合均勻。短暫離心后，將離心管至于56℃水浴中過夜消化處理。加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將DNA制備管至于2ml離心管中，將離心后的混合液上清移至制備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重復一次去鹽過程。棄濾液后，離心一分鐘。將DNA制備管轉移到新的1.5ml離心管中，加入56℃預熱的Tris-HCl洗脫液100μl洗脫制備管中DNA，-20℃冷凍備用。