[發明專利]一種快速分析微生物多態性動態變化的微型熒光凝膠電泳方法

在審

• 申請號: 201710139282.7
• 申請日: 2017-03-09
• 公開（公告）號: CN106868151A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 劉建華;何靖;程濤;梁冀北;胡興翠
• 申請（專利權）人: 浙江大學舟山海洋研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司33109
• 代理人: 尉偉敏,趙越劍

技術領域

本發明涉及一種微生物多態性動態變化監測方法，特別涉及一種快速分析微生物多態性動態變化的微型熒光凝膠電泳方法。

背景技術

限制性片段長度多態性(RFLP)是微生物多態性分析中重要的分子生物學分子方法?；驹硎菍Σ煌纳锓N群或微生物類群特定的DNA片段進行限制性內切酶酶切，不同微生物DNA片段中酶切位點不同，產生酶切片段大小和數量不同，通過對酶切DNA片段分析獲得微生物多樣性結果。RFLP可以檢測到酶切位點因DNA變異造成的酶切片段長度的差異，分辨率高，重復性強。通過RFLP的方法進行檢測和篩選，簡單，成本低廉，高效快速，因此能夠大大節約實驗成本和時間。關于RFLP技術已有報道，但是利用該技術監測微生物組分動態變化卻沒報道。目前最常用的檢測環境微生物是高通量測序的方法，這種方法需要提供高質量的基因組DNA，而且費用非常昂貴，整個過程比較耗時，而且可重復性比較差。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速分析微生物多態性動態變化的微型熒光凝膠電泳方法，簡單易行，成本低，高效快速，重復性好。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種快速分析微生物多態性動態變化的微型熒光凝膠電泳方法，包括如下步驟：

(1)用引物PCR擴增微生物16S rDNA，引物為27F和1492R，其中27F的5’端有FAM熒光標記，并將PCR產物進行測序，通過與NCBI數據庫進行序列比對確定菌種；

(2)利用HhaⅠ限制性內切酶切割PCR產物，會產生多條大小不一的片段，每條16S rDNA只有最左端限制性酶切片段具有熒光標記，其它片段沒有熒光標記；

(3)利用微型垂直PAGE凝膠電泳分離各個微生物物種的熒光標記片段，最后通過熒光成像系統觀察凝膠，根據片段大小、熒光強弱，確定各微生物物種的動態變化。

作為優選，步驟(1)中，27F的核苷酸序列為：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)，M為A或C；1492R的核苷酸序列為：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)，Y為C或T。

作為優選，步驟(1)中，PCR擴增體系：5μl的10×Buffer，4μl的dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5mM的混合物)，1.5μl的27F(濃度為10μM)，1.5μl的1492R(濃度為10μM)，0.25μl的rTaq酶(濃度為10U/μl)，1μl的DNA模板，用ddH₂O補足至50μl；PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循環40次；最后72℃延伸10min。

作為優選，步驟(2)中，HhaⅠ限制性內切酶酶切反應體系如下：10×buffer7μl，HhaⅠ限制性內切酶0.5μl(濃度為10U/μl)，PCR產物47μl，ddH₂O 15.5μl；酶切反應條件為：37℃恒溫金屬浴過夜。

作為優選，步驟(3)中，電泳緩沖液為TBE，電泳條件為100v恒壓，2h。作為優選，電泳凝膠的配方為：蒸餾水5.5mL，30％Acr-Bis(30％為Acr-Bis(質量比為29:1)的混合物質量濃度)25mL，1M的pH 8.8Tris 19mL，10％過硫酸銨(10％質量濃度)0.5mL，TEMED 0.02mL。

本發明的有益效果是：簡單易行，成本低，高效快速，重復性好，應用性廣，可廣泛應用于原核生物的研究。

附圖說明

圖1是在不同培養條件下生物表面活性劑和石油降解微生物的變化。A，油污微生物在MSM+YE培養基條件下的生長曲線，B，油污微生物在MSM+Glu培養基條件下的生長曲線，C，在MSM+YE培養基條件下，油污微生物件隨著時間的變化而發生種類的動態變化，D，在MSM+Glu培養基條件下，油污微生物件隨著時間的變化而發生種類的動態變化。

圖2是在MSM+YE和MSM+Glu兩種培養基條件下積累的優勢菌種的生長曲線。A，Alcaligenes CT10，B，Donghicola，C，Bacillus CT6，D，Pseudomonas ZS1。