[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速分析微生物多態(tài)性動(dòng)態(tài)變化的微型熒光凝膠電泳方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710139282.7
• 申請(qǐng)日: 2017-03-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106868151A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉建華;何靖;程濤;梁冀北;胡興翠
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江大學(xué)舟山海洋研究中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州杭誠(chéng)專(zhuān)利事務(wù)所有限公司33109
• 代理人: 尉偉敏,趙越劍

1.一種快速分析微生物多態(tài)性動(dòng)態(tài)變化的微型熒光凝膠電泳方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)用引物PCR擴(kuò)增微生物16S rDNA，引物為27F和1492R，其中27F的5’端有FAM熒光標(biāo)記，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)確定菌種；

(2)利用Hha Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，會(huì)產(chǎn)生多條大小不一的片段，每條16S rDNA只有最左端限制性酶切片段具有熒光標(biāo)記，其它片段沒(méi)有熒光標(biāo)記；

(3)利用微型垂直P(pán)AGE凝膠電泳分離各個(gè)微生物物種的熒光標(biāo)記片段，最后通過(guò)熒光成像系統(tǒng)觀察凝膠，根據(jù)片段大小、熒光強(qiáng)弱，確定各微生物物種的動(dòng)態(tài)變化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微型熒光凝膠電泳方法，其特征在于，步驟(1)中，27F的核苷酸序列為：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，M為A或C；1492R的核苷酸序列為：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，Y為C或T。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微型熒光凝膠電泳方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴(kuò)增體系：5μl的10×Buffer，4μl的dNTP，1.5μl的27F，1.5μl的1492R，0.25μl的rTaq酶，1μl的DNA模板，用ddH₂O補(bǔ)足至50μl；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循環(huán)40次；最后72℃延伸10min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微型熒光凝膠電泳方法，其特征在于，步驟(2)中，Hha Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶酶切反應(yīng)體系如下：10×buffer 7μl，Hha Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶0.5μl，PCR產(chǎn)物47μl，ddH₂O 15.5μl；酶切反應(yīng)條件為：37℃恒溫金屬浴過(guò)夜。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微型熒光凝膠電泳方法，其特征在于，步驟(3)中，電泳緩沖液為T(mén)BE，電泳條件為100v恒壓，2h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微型熒光凝膠電泳方法，其特征在于，電泳凝膠的配方為：蒸餾水5.5mL，30％Acr-Bis 25mL，1M的pH 8.8Tris 19mL，10％過(guò)硫酸銨0.5mL，TEMED 0.02mL。