[發明專利]一種免標記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201710133448.4
• 申請日: 2017-03-08
• 公開（公告）號: CN107012208B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 陳俊華;李芳柏
• 申請（專利權）人: 廣東省生態環境技術研究所
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

1.一種免標記鉛離子可視化檢測試劑盒，包括DNA雜交緩沖液，顯色緩沖液體系，氯高鐵血紅素，其特征在于，還包括下列成分：

底物鏈核酸序列17DS：堿基數為40-48個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列；其中rA為切割位點，rA-G左右兩旁的5個堿基與17E互補；17DS的3'端有至少6個堿基不與17E互補；當有鉛離子存在時，催化鏈切割底物鏈，切割位點為rA，切割后的底物鏈分割為兩部分，其中靠近17DS的5'端部分記名為A區，用于啟動下一步反應；

催化鏈核酸序列17E：堿基數為36-42個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列，其中TCCGAGCCGGTCGAAA構成一個凸起部分，凸起部分左右兩旁的5個堿基與17DS互補；17E的3'端至少有6個堿基不與17DS互補；

核酸序列H1；從3'端開始依次為B區域、C區域和D區域，其中C區和部分D區互補，構成莖環結構的莖部分，B凸起于莖結構外；H1的B與17DS切割后的A區的5'端互補，A的3'端凸起；D區為富含G堿基的核酸序列，加入氯高鐵血紅素后，會形成具有催化活性的G四聚體結構；

以及核酸外切酶III。

2.根據權利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的D區域的核酸序列包含有四組GGG序列，各組GGG序列中間隔1-3個非G堿基。

3.根據權利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的D區域的核酸序列為GGGTAGGGCGGGTTGGG。

4.根據權利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的C區堿基數為5-10個。

5.根據權利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的C區堿基數為7個。

6.根據權利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：雜交緩沖液為Tris-HCl緩沖液，20mM，pH為7.4，含有200mM NaCl以及50mM KCl。

7.根據權利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：顯色緩沖液體系由顯色緩沖液、底物以及雙氧水構成，包括四甲基聯苯胺-雙氧水緩沖液體系、鄰苯二胺-雙氧水緩沖液體系或2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水緩沖液體系。

8.據權利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：底物鏈核酸序列17DS，催化鏈核酸序列17E，核酸序列H1，其序列如下所示：

17DS：5'-CGACATCTACCTAGCACTCACTAT-rA-G-GAAGAGATGAAAAAA-3'；

17E:5'-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTGAGTAAAAAA-3'；

H1:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTACCC-AGTGCTAGGTAGATGTCG-3'。

9.一種免標記鉛離子可視化檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)先用DNA雜交緩沖液分別溶解17DS、17E以及H1，將等量的17DS與17E混合，室溫反應30分鐘，形成17DS-17E混合物；

2)將待測溶液加入到17DS-17E混合物中，室溫反應45分鐘，完成切割反應；

3)加入H1和核酸外切酶III，室溫反應90分鐘；

4)加入適量氯高鐵血紅素，室溫反應30分鐘，取出50μL反應液，加入到950μL顯色緩沖液體系中，室溫反應15分鐘，觀察顏色變化；當有鉛離子時，溶液顯色，當沒有鉛離子時，溶液無色；其中，17DS、17E、H1以及DNA雜交緩沖液，顯色緩沖液體系如權利要求1～8任意一項所示。