[發(fā)明專利]一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710133448.4 | 申請日： | 2017-03-08 |
| 公開（公告）號： | CN107012208B | 公開（公告）日： | 2020-09-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳俊華;李芳柏 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/682 | 分類號： | C12Q1/682 |
| 代理公司： | 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205 | 代理人： | 胡輝 |
| 地址： | 510650 *** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 標(biāo)記 離子 可視化 檢測 方法 試劑盒 | ||
1.一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測試劑盒，包括DNA雜交緩沖液，顯色緩沖液體系，氯高鐵血紅素，其特征在于，還包括下列成分：
底物鏈核酸序列17DS：堿基數(shù)為40-48個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列；其中rA為切割位點，rA-G左右兩旁的5個堿基與17E互補；17DS的3'端有至少6個堿基不與17E互補；當(dāng)有鉛離子存在時，催化鏈切割底物鏈，切割位點為rA，切割后的底物鏈分割為兩部分，其中靠近17DS的5'端部分記名為A區(qū)，用于啟動下一步反應(yīng)；
催化鏈核酸序列17E：堿基數(shù)為36-42個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列，其中TCCGAGCCGGTCGAAA構(gòu)成一個凸起部分，凸起部分左右兩旁的5個堿基與17DS互補；17E的3'端至少有6個堿基不與17DS互補；
核酸序列H1；從3'端開始依次為B區(qū)域、C區(qū)域和D區(qū)域，其中C區(qū)和部分D區(qū)互補，構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，B凸起于莖結(jié)構(gòu)外；H1的B與17DS切割后的A區(qū)的5'端互補，A的3'端凸起；D區(qū)為富含G堿基的核酸序列，加入氯高鐵血紅素后，會形成具有催化活性的G四聚體結(jié)構(gòu)；
以及核酸外切酶III。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的D區(qū)域的核酸序列包含有四組GGG序列，各組GGG序列中間隔1-3個非G堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的D區(qū)域的核酸序列為GGGTAGGGCGGGTTGGG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的C區(qū)堿基數(shù)為5-10個。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：H1的C區(qū)堿基數(shù)為7個。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：雜交緩沖液為Tris-HCl緩沖液，20mM，pH為7.4，含有200mM NaCl以及50mM KCl。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：顯色緩沖液體系由顯色緩沖液、底物以及雙氧水構(gòu)成，包括四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水緩沖液體系、鄰苯二胺-雙氧水緩沖液體系或2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水緩沖液體系。
8.據(jù)權(quán)利要求1所述的鉛離子可視化檢測試劑盒，其特征在于：底物鏈核酸序列17DS，催化鏈核酸序列17E，核酸序列H1，其序列如下所示：
17DS：5'-CGACATCTACCTAGCACTCACTAT-rA-G-GAAGAGATGAAAAAA-3'；
17E:5'-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTGAGTAAAAAA-3'；
H1:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTACCC-AGTGCTAGGTAGATGTCG-3'。
9.一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：
1)先用DNA雜交緩沖液分別溶解17DS、17E以及H1，將等量的17DS與17E混合，室溫反應(yīng)30分鐘，形成17DS-17E混合物；
2)將待測溶液加入到17DS-17E混合物中，室溫反應(yīng)45分鐘，完成切割反應(yīng)；
3)加入H1和核酸外切酶III，室溫反應(yīng)90分鐘；
4)加入適量氯高鐵血紅素，室溫反應(yīng)30分鐘，取出50μL反應(yīng)液，加入到950μL顯色緩沖液體系中，室溫反應(yīng)15分鐘，觀察顏色變化；當(dāng)有鉛離子時，溶液顯色，當(dāng)沒有鉛離子時，溶液無色；其中，17DS、17E、H1以及DNA雜交緩沖液，顯色緩沖液體系如權(quán)利要求1～8任意一項所示。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所，未經(jīng)廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
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