[發明專利]一種免標記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201710133448.4
• 申請日: 2017-03-08
• 公開（公告）號: CN107012208B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 陳俊華;李芳柏
• 申請（專利權）人: 廣東省生態環境技術研究所
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種免標記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒。以鉛離子特異性識別的脫氧核酶為分子識別元件，設計莖環結構核酸，結合核酸外切酶III的選擇性切割作用，實現檢測信號的循環放大。以G?四聚體為信號報告分子，實現免標記分析。本發明具有較高的靈敏度，對鉛離子的檢測限為10 pM，檢測具有很好的特異性，常見干擾物對檢測不產生影響。檢測過程無需檢測儀器，結果直接肉眼可見，具有操作簡單，成本低廉，響應迅速等優點，可用于環境或食品樣品中鉛離子含量的快速檢測。

技術領域

本發明屬于分析檢測領域，具體涉及一種免標記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

鉛離子（Pb²⁺）是一種有神經毒性的重金屬元素，對人體危害嚴重，可對神經系統、血液系統、消化系統和腎臟等造成危害。美國環境保護署規定飲用水中鉛離子的最大允許量不得超過72 nM。

目前，常規的鉛離子檢測方法主要有原子吸收光譜，電感耦合等離子體質譜法，原子熒光光譜等方法。這些方法需要分離富集，操作繁瑣費時或需配置大型儀器，不利于快速現場檢測。近年來，利用對Pb²⁺敏感的脫氧核酶（17DS-17E DNAzyme）為分子識別元件檢測Pb²⁺的方法備受關注（D. Mazumdar, J. Liu, G.Lu, J. Zhou and Y. Lu, Chem.Commun., 2010, 46, 1416-1418），已建立熒光、電化學以及膠體金比色法等分析技術，但大多需要進行標記， 或需要使用檢測儀器獲得數據，因而限制了這些技術的廣泛應用。因此，迫切需要建立一種新型檢測技術用于鉛離子的檢測，使檢測過程無需使用檢測儀器，檢測結果直接肉眼可見，并使檢測體系無需標記，從而節約成本。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明旨在利用鉛離子特異性識別的脫氧核酶為識別元件，結合工具酶介導的信號擴增，以G-四聚體為信號報告分子，建立一種免標記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒。

本發明所采取的技術方案是：

一種免標記鉛離子可視化檢測試劑盒，包括DNA雜交緩沖液，顯色緩沖液體系，氯高鐵血紅素，還包括下列成分：核酸序列17DS、17E、H1以及核酸外切酶III。

具體分析如下：

底物鏈核酸序列17DS：堿基數為40-48個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列（鉛離子（Pb²⁺）特異性識別的脫氧核酶）；其中rA為切割位點，rA-G左右兩旁的5個堿基與17E互補；17DS的3'端有至少6個堿基不與17E互補，在17E的3'端有至少6個堿基不與17DS互補（防止17DS-17E被核酸外切酶III切掉）；當有鉛離子存在時，催化鏈切割底物鏈，切割位點為rA，切割后的底物鏈分割為兩部分，其中靠近17DS的5'端部分記名為A區，用于啟動下一步反應；如果沒有鉛離子存在，那么催化鏈和底物鏈還是繼續互補結合在一起。

催化鏈核酸序列17E：堿基數為36-42個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列（鉛離子（Pb²⁺）特異性識別的脫氧核酶），其中TCCGAGCCGGTCGAAA構成一個凸起部分，凸起部分左右兩旁的5個堿基與17DS互補；17E的3'端至少有6個堿基不與17DS互補；其反應原理見上說明。