[發明專利]生物制劑血藥濃度檢測方法及試劑

在審

• 申請號: 201710131480.9
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN108535490A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 李振軍;陳菲;周鵬飛
• 申請（專利權）人: 蘇州和銳生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種抑制TNF?α的生物制劑血藥濃度檢測方法及檢測試劑，其特征在于，包括步驟：1)用抗單抗藥物的抗體或親和肽捕獲血中的單抗藥物，形成單抗藥物與抗體的復合物，或單抗藥物與親和肽的復合物；2)用該單抗藥物的抗原檢測步驟1)的復合物。本發明具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優點。

技術領域

本發明屬于免疫檢測領域，具體地涉及一種抑制TNF-α的生物制劑血藥濃度檢測方法及檢測試劑。

背景技術

腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)，按其結構分兩型：TNF-α和TNF-β，其中由活化的巨噬細胞、單核細胞和T細胞產生的能使腫瘤壞死的因子稱為TNF-α；而把由活化的T細胞和NK細胞產生的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)稱為TNF-β。目前研究較多的是TNF-α，它是一種由157個氨基酸組成、相對分子質量為17kD的可溶性多肽，成熟型TNF-α的活性形式為三聚體。

TNF-α具有雙重生物學效應，在濃度較低時，TNF-α主要作為白細胞和內皮細胞的自分泌及旁分泌的調節物，參與抵抗細菌、病毒和寄生蟲的感染，促進組織修復及調節炎癥反應，引起腫瘤細胞凋亡等；在高濃度時，過量的TNF-α在體內的大量產生和釋放則會破壞機體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產生多種病理損傷。TNF-α對眾多的組織器官產生生物學效應，是細胞因子網絡中一個重要的多功能成員，是機體維持內部自穩、抵御各種致病因子必不可少的免疫調節因子。

靶向TNF-α的治療性單抗是目前用于自身免疫性疾病最成功的一類生物制劑，可用于治療類風濕性關節炎、多發性硬化癥、克羅恩病及強直性脊柱炎。目前，抑制TNF-α的治療性單抗或生物制劑包括英夫利西單抗(Infliximab)、阿達木單抗(Adalimumab)、依那西普(Etanercept)、賽妥珠單抗(Certolizumab Pegol)和戈利木單抗(Golimumab)。這些生物制劑都能結合游離的以及膜結合的TNF-α，抑制其與受體結合，阻斷其生物效應，但是不同形式的生物制劑通過不同的機制發揮作用。

這些生物制劑的應用，會出現自身抗體的誘導、不良藥物反應(ADR)、生物利用度和抗體清除等問題，因此，檢測患者血清中抑制TNF-α的生物制劑藥物濃度，對于患者的用藥有較大的指導意義，更有利于患者選擇有針對性的治療方法。

檢測TNF-α抑制劑的生物制劑血藥濃度難點在于，結合TNF-α的不同抗體藥物均不同程度地實現人源化，而且TNF-α有多個不同結合位點，使得檢測某種抗體藥很容易受到內源性抗體的干擾。國外在中國申請的專利No.102695955A公開了一種檢測TNF-α抑制劑的方法：熒光標記TNF-α，然后檢測樣中加入一定量的標TNF-α標記物，標記物與樣品中的抗體血藥形成標記復合物，再進一步排阻層析，通過積分復合物峰曲線下面積測得TNF-α抑制劑的濃度，此種方法比較繁鎖而且檢測速度慢。鄒有土、白羊、葛平輝等發表了《阿達木單抗ELISA定量檢測方法的建立》(《中國醫藥生物技術》2015年第2期)，其檢測阿達木的方法是以hTNF抗原為包被抗原，羊抗人IgG-HRP為檢測抗體，建立了定量測定阿達木單抗的ELISA方法，但這種方法對于TNF-α不抑制的抗體藥存在明顯的非特異性。本發明在抗制備生物制劑的抗體時，為了使制備的抗體具有高度特異性，針對性地把生物制劑的人源化序列置換為所免疫動物免疫球蛋白的相應恒定區序列，從而使本發明試劑比現有試劑具有更好的特異性。中國專利CN201410619644.9公開了一種重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度測定方法，其特征是，通過利用鏈霉親和素偶聯的磁珠及生物標記的抗TNFRII單克隆抗體純化正常人血清，去除內源性TNF-αRII的正常人血清作為待測樣品的稀釋液，以此來提高定量的靈敏度，但此方法顯然也很繁鎖，人血清存在風險，而且來源有限，不適宜商品化的診斷試劑生產，也不適用于其它生物制劑血藥檢測。

因此檢測TNF-α抑制劑的血藥濃度需要建立一種簡便、快速、特異性高的方法。

發明內容

定義：