[發明專利]一種建立農桿菌介導香鱗毛蕨配子體遺傳轉化體系的方法

有效

• 申請號: 201710129897.1
• 申請日: 2017-03-07
• 公開（公告）號: CN108570478B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 常纓;卜志剛;陳玲玲;陶文青;張常旭;王琪
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H9/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種建立農桿菌介導香鱗毛蕨配子體遺傳轉化體系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)預培養：將香鱗毛蕨配子體置于培養基上進行預培養，預培養時間為2天；

2)農桿菌菌液的制備：用植物雙元表達載體轉化農桿菌，然后將含有植物雙元表達載體的農桿菌擴大培養后收集菌體，重懸后獲得農桿菌菌液,所述農桿菌菌液的OD₆₀₀＝0.5；

3)農桿菌菌液的浸染；將步驟1)中經過預培養的香鱗毛蕨配子體浸泡于步驟2)獲得的農桿菌菌液中進行侵染，侵染時間為10min；

4)菌和延遲培養：除菌后進行延遲培養，所述除菌是將經過農桿菌浸染后的配子體用200mg/L-500mg/L的頭孢霉素無菌水清洗后，接種到含有300mg/L頭孢霉素的培養基上；所述延遲培養的時間為15d；

5)檢測篩選：最后對目標基因進行檢測，篩選后得到具有可遺傳目標基因的香鱗毛蕨植株；所述篩選是在含有300mg/L頭孢霉素和200mg/L卡那霉素的培養基上篩選30d。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述植物雙元表達載體上質粒攜帶有GUS報告基因，CaMV啟動子和篩選標記基因。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述植物雙元表達載體為PBI 121。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)預培養：將香鱗毛蕨配子體置于培養基上進行預培養2d；

2)農桿菌菌液的制備：用載體PBI 121轉化農桿菌LB4404，然后將含有PBI 121載體的農桿菌LB4404擴大培養后收集菌體，重懸后使OD₆₀₀為0.5，獲得農桿菌菌液；

3)農桿菌菌液的浸染；將步驟1)中經過預培養的香鱗毛蕨配子體浸泡于步驟2)獲得的農桿菌菌液中進行侵染10min；

4)將經過農桿菌浸染后的配子體用200mg/L-500mg/L的頭孢霉素無菌水清洗后，接種到含有300mg/L頭孢霉素的培養基上，然后進行延遲培養15d；

5)最后對GUS基因進行檢測，在含有300mg/L頭孢霉素和200mg/L卡那霉素的培養基上篩選30d，得到具有可遺傳目標基因的香鱗毛蕨植株。