[發明專利]一種建立農桿菌介導香鱗毛蕨配子體遺傳轉化體系的方法

有效

• 申請號: 201710129897.1
• 申請日: 2017-03-07
• 公開（公告）號: CN108570478B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 常纓;卜志剛;陳玲玲;陶文青;張常旭;王琪
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H9/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發明公開了一種建立農桿菌介導香鱗毛蕨配子體遺傳轉化體系的方法，屬于香鱗毛蕨遺傳轉化技術領域。本發明所提供的方法為是以香鱗毛蕨配子體為受體，用植物雙元表達載體轉化農桿菌，將經過預培養的香鱗毛蕨配子體浸泡于轉化后的農桿菌菌液中侵染，除菌后進行延遲培養，最后對目標基因進行檢測，篩選后得到具有可遺傳目標基因的香鱗毛蕨植株。該方法過程簡單，操作方便，成本低廉，能在較短的時間內完成香鱗毛蕨遺傳轉化體系的建立，為今后進一步研究相關基因合成和調控的特性，轉入抗性基因，創新蕨類植物的種質資源和遺傳轉化奠定基礎。適用于香鱗毛蕨的遺傳轉化。

技術領域

本發明涉及一種建立農桿菌介導香鱗毛蕨配子體遺傳轉化體系的方法，屬于香鱗毛蕨遺傳轉化技術領域。

背景技術

香鱗毛蕨(Dryopteris fragrans(L.)schoot.)是一種重要的藥用植物，由于其對皮膚病有很好的療效，逐漸被人們重視。目前國內外對香鱗毛蕨的研究主要集中在其藥用成分、藥理作用、形態解剖學以及資源分布研究比較多，而對于分子生物學方面的研究比較少。在蕨類植物中進行遺傳轉化卻非常困難，因為蕨類植物的生活史有明顯的世代交替現象，生長周期較長，目前，在蕨類植物中只有水蕨建立了轉化體系，其他蕨類植物的轉化體系尚未研究，且對于蕨類植物而言農桿菌介導的轉基因還沒有成功的例子，目前在蕨類植物中進行遺傳轉化可行的方法就是利用基因槍法，但是到目前為止依然沒有辦法得到穩定的轉化效果。韓靜丹(2012)對鐵線蕨的轉基因的兩種方法進行了研究，結果表明，農桿菌介導的遺傳轉化由于再生過程中抑菌劑的影響致使材料褐化率高，難以繼續分化；而基因槍法由于在轟擊過程中受到較大程度的污染，致使材料在再生過程難以繼續生長，均未能建立穩定的再生體系。但近幾年，國外用水蕨的配子體和愈傷組織為受體材料，利用基因槍和農桿菌介導法成功的將外源基因導入到受體細胞內，所以建立蕨類遺傳轉化體系成為可能。目前關于香鱗毛蕨轉基因的研究尚未報道，還沒有建立一個高效、穩定的遺傳轉化體系，更沒有找到一種比較成熟的香鱗毛蕨遺傳轉化體系的建立方法。

發明內容

為建立一種高效、穩定的香鱗毛蕨遺傳轉化體系，本發明提供了一種建立農桿菌介導香鱗毛蕨配子體遺傳轉化體系的方法，采用的技術方案如下：

本發明的目的在于提供一種建立農桿菌介導香鱗毛蕨配子體遺傳轉化體系的方法，該方法包括以下步驟：

1)預培養：將香鱗毛蕨配子體置于培養基上進行預培養；

2)農桿菌菌液的制備：用植物雙元表達載體轉化農桿菌，然后將含有植物雙元表達載體的農桿菌擴大培養后收集菌體，重懸后獲得農桿菌菌液；

3)農桿菌菌液的浸染；將步驟1)中經過預培養的香鱗毛蕨配子體浸泡于步驟2)獲得的農桿菌菌液中進行侵染；

4)除菌和延遲培養：除菌后進行延遲培養；

5)檢測篩選：最后對目標基因進行檢測，篩選后得到具有可遺傳目標基因的香鱗毛蕨植株。

優選地，步驟1)所述預培養的時間為0d-3d。

優選地，步驟2)所述植物雙元表達載體上質粒攜帶有GUS報告基因，CaMV啟動子和篩選標記基因。

更優選地，步驟2)所述植物雙元表達載體為PBI 121。

優選地，步驟1)所述農桿菌為LB4404。

優選地，步驟1)所述農桿菌菌液的OD₆₀₀＝0.5-0.6。最優為0.5。

優選地，步驟3)所述侵染，時間為10min-15min。最優選為10min。

優選地，步驟4)所述除菌是將經過農桿菌浸染后的配子體用200mg/L-500mg/L的頭孢霉素無菌水清洗后，接種到含有200mg/L-300mg/L頭孢霉素的培養基上。