[發明專利]一種雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表達基因與應用

有效

• 申請號: 201710128644.2
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN106811450B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 肖敏;陳曉迪;盧麗麗;徐莉
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12P13/06;C12P13/08;C12P21/00
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發明涉及一種雙功能轉糖基α?N?乙酰氨基半乳糖苷酶及其表達基因與應用。該酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，雙功能轉糖基α?N?乙酰氨基半乳糖苷酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明所述雙功能α?N?乙酰氨基半乳糖苷酶可以高效合成Tn抗原和T抗原以及相應糖肽，所采用的α?N?乙酰氨基半乳糖苷酶在以絲氨酸、蘇氨酸或短肽(STAPPA)為受體底物的反應體系中合成GalNAc?α?Ser/Thr、Galβ1?3GalNAc?α?Ser/Thr和GalNAc/Galβ1?3GalNAc?α?STAPPA糖綴合物的反應過程中，產率顯著高于現有已知相關酶，具有潛在的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表達基因與應用，特別涉及利用一種同時具有內切酶和外切酶活性的雙功能α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶合成T抗原和Tn抗原以及相應糖肽的方法，屬于基因工程技術領域。

技術背景

α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(α-N-Acetylgalactosaminidase，EC.3.2.1.49)是一類重要的糖苷水解酶，催化α-N-乙酰氨基半乳糖苷鍵的水解，廣泛分布于細菌、真菌、植物和動物中，根據氨基酸序列同源性歸屬于糖苷酶家族GH27、GH36、GH109和GH129(http://www.cazy.org/)。其中，細菌來源的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在GH36、GH109、GH129個家族中有分布，真核生物來源的主要屬于GH27。該類酶既可以水解簡單的α-N-乙酰氨基半乳糖苷，也可以作用于含α-N-乙酰氨基半乳糖苷鍵的大分子，如多糖、糖蛋白和糖脂。此外，某些α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶不僅具有水解功能，在體外合適的反應條件下還具有轉α-N-乙酰氨基半乳糖苷的活性，合成重要N-乙酰氨基半乳糖苷化合物，應用于基礎研究、農業和醫藥等領域，但目前報道的酶轉糖基產物產量很低。

α-N-乙酰氨基半乳糖苷化合物的合成具有重要意義，如T抗原(Galβ1-3GalNAc-α-Ser，Galβ1-3GalNAc-α-Thr)和Tn抗原(GalNAc-α-Ser，GalNAc-α-Thr)屬于Mucin-type O-glycan，但目前糖苷酶法合成Tn抗原(GalNAc-α-Ser，GalNAc-α-Thr)的產率不超過10％；合成T抗原(Galβ1-3GalNAc-α-Ser，Galβ1-3GalNAc-α-Thr)的產率不超過17％；合成相應糖肽的產率不超過11％。未見一種酶同時具有內切酶和外切酶活性的雙功能，能夠合成T抗原和Tn抗原以及相應糖肽的報道。由于現有的合成方法均存在局限性，使得α-N-乙酰氨基半乳糖類糖綴合物的商品價格一直非常昂貴，需要尋找新的酶和經濟有效的合成方法。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表達基因與應用。

發明概述

本發明的技術要點是發現了一種同時具有內切酶和外切酶活性的雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，并利用該酶以對硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖或對硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖-β1,3-D-半乳糖為糖基供體，以絲氨酸、蘇氨酸或短肽為受體，一步轉糖基反應高效合成Tn抗原和T抗原以及相應糖肽。

發明詳述

一種雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在制備Tn抗原、T抗原或糖肽中的應用。

上述應用，步驟如下：