[發明專利]一種雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表達基因與應用

有效

• 申請號: 201710128644.2
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN106811450B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 肖敏;陳曉迪;盧麗麗;徐莉
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12P13/06;C12P13/08;C12P21/00
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.雙功能轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在制備Tn抗原、T抗原或糖肽中的應用，其特征在于，步驟如下：

將轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶與糖基供體、糖基受體溶液混合，配制成pH 5.0～6.0的反應體系，反應體系中，糖基供體反應濃度為5～10mM，糖基受體反應濃度為200～300mM，在45～55℃條件下，反應10～120 min，終止反應，純化，制得Tn和T抗原以及相應糖肽；

所述轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述糖基供體為對硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖或對硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖-β1,3-D-半乳糖；

所述糖基受體為絲氨酸、蘇氨酸或氨基酸序列為STAPPA的短肽。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的反應濃度為0.1～0.9 U/ml。

3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，制備方法如下：

（1）將核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入質粒pET-21b中，轉化大腸桿菌BL21（DE3），制得重組大腸桿菌；

（2）將步驟（1）制得的重組大腸桿菌經擴大培養，再經過誘導培養后，收集細胞，細胞破碎、純化，制得轉糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟（1）中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以長雙歧桿菌（Bifidobacteriumlongum）JCM1217的基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得，PCR引物核苷酸序列如下所示：

引物F：5’-CGCGCATATGATGGAATTCACCGTATCCGGCACTA -3’

引物R:：5’-ATATAAGCTTGTGATGCGGGCAGTCGGTGATG -3’

PCR體系如下，總體積100μL：

10×PCR buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP 8μL、20μmol/L引物F 2μL、20μmol/L引物R 2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μLTaKaRaLATaq酶1μL，超純水76μL；

PCR擴增程序如下：

95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，反應30個循環；72℃延伸10分鐘。

5.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟（2）中，擴大培養條件為：37℃、150～180r/min培養至OD₆₀₀為0.4～0.8。

6.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟（2）中，擴大培養基為LB培養液，配制方法如下：

蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.0，121℃滅菌20分鐘。

7.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟（2）中，擴大培養基還包括濃度為40～60μg/mL的氨芐霉素。

8.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟（2）中，誘導培養為在擴大培養后，向培養液中加入IPTG，使培養液中IPTG的濃度為0.1～0.5 mM，在16～25℃、100r/min繼續過夜培養。

9.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述反應體系由濃度為50mM的磷酸鈉緩沖液配制，pH為6.0。

10.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述純化采用HPLC進行純化。