[發明專利]奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗的組合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710128121.8
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN107224575B
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;賈寶琴;查銀河
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/085
• 分類號: A61K39/085;A61K39/39;A61P31/04;A61P15/14
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發明公開了一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗的組合物及其制備方法和應用。該組合物包含α?溶血素蛋白、β?溶血素蛋白、PVL?S蛋白以及藥學上可接受的佐劑或α?溶血素蛋白、β?溶血素蛋白、PVL?F蛋白以及藥學上可接受的佐劑；其制備方法包括以下步驟：1)分別制備α?溶血素蛋白、β?溶血素蛋白、PVL?F蛋白、PVL?S蛋白；2)將1)中制備的α?溶血素蛋白、β?溶血素蛋白、PVL?F蛋白或α?溶血素蛋白、β?溶血素蛋白、PVL?S蛋白制備成抗原液；3)根據制備的組合物的體積，準備好硫柳汞，并將準備好的硫柳汞加入到2)抗原液中制備成水相；4)將水相與ISA 201 VG佐劑按照體積比46:55混合乳化。該組合物能誘發機體產生特異性抗體，產生很好的交叉保護反應。

技術領域

本發明涉及一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗組合物及其制備方法和應用。屬于獸用疫苗技術領域。

背景技術

奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病之一，主要是奶牛乳腺組織受到微生物感染后而引起的一種炎癥，多發生于產后哺乳期，該病廣泛存在于世界各地，為奶牛常見病、多發病，是造成乳制品業經濟損失最為嚴重的疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原微生物大約有150多種，主要以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌為主，這三種細菌引起的奶牛乳房炎占總發病率的90％以上，其中尤以金黃色葡萄球菌為最。

當前奶牛乳房炎的治療主要是抗生素治療。抗生素用于治療奶牛乳房炎已有50多年的歷史，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于長期單一的、大劑量、不科學使用抗生素，造成了敏感性細菌消除，耐藥性細菌逐漸占了主流，尤其是金黃色葡萄球菌的耐藥問題日益嚴重，導致了抗生素治療收效甚微；另一方面，隨著生活水平的提高，牛奶中抗生素殘留是一個非常嚴重的健康問題。

用疫苗防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以預防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的嚴重程度，控制亞臨床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不會存在乳汁中抗生素殘留問題；最后是操作簡便，費用低廉。當前，研制成功的疫苗很少，且大都數為弱毒活菌苗或滅活菌苗，在生產實踐中，對乳房炎的防治有一定作用，然而隨著大規模集約化養殖的發展，人工致弱菌株存在著同源重組、自身毒力返強等潛在可能，而滅活疫苗也存在使用劑量大、滅活不徹底等不足，為提高傳統疫苗的安全性與免疫保護力，高效、廉價的新型疫苗研制極為重要。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱SA)，也稱“金葡菌”，是一種革蘭氏染色陽性的球菌，直徑0.8μm，在顯微鏡下排列成葡萄串狀，并可以產生金黃色的色素，因此而得名。金葡菌是引起慢性/隱性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶的產量和質量，給奶制品產業帶來巨大的經濟損失。

α-溶血素(α-hemolysin)，亦稱α-toxin，是由金葡菌分泌的一種外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。α-溶血素屬于中空形狀的β-桶狀結構細菌毒素家族，相對分子質量為33,200，由297個氨基酸組成，其結構基因為hla。α-溶血素對多種哺乳動物紅細胞具有溶血作用，其機理為毒素分子插入紅細胞的細胞膜疏水區，形成微孔，破壞了膜的完整性，造成細胞溶解。將α-溶血素第35位組氨酸突變為丙氨酸后，突變體就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用來免疫動物，是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一。

β溶血素(亦稱β-toxin)就是其毒素之一，它具有白細胞毒性、溶血活性等特性。β溶血素是由330個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為37～39kDa，其等電點(pI)高于9。β溶血素是一種鎂依賴神經酯酶，具有磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)活性，可以分解甘油磷酸膽堿，β溶血素依靠這種酶活性，水解組成細胞膜的磷脂雙分子層，從而破壞細胞膜的完整性，導致細胞裂解，引起溶血。將β溶血素進行定點突變后，突變體就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用來免疫動物，是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一。