[發明專利]產腈水解酶的酵母菌株選育及其在腈類化合物生物轉化中的應用

有效

• 申請號: 201710127903.X
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN107022497B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 許正宏;史勁松;張強;龔勁松;李恒;竇文芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/02;C12P7/42;C12R1/645
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林

本發明屬于工業生物技術領域，特別涉及一種腈水解酶產生酵母菌的篩選方法及其在腈類化合物生物轉化制備3?羥基丙酸中的應用。本發明提供了一種產腈水解酶的酵母菌的篩選方法，首次篩選到了一株可轉化3?羥基丙腈合成3?羥基丙酸的酵母菌株3H2?2，結合形態、生理生化特性以及18S和ITS測序分析，將其鑒定為季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)。該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號CGMCC No.12935)。添加3％葡萄糖作為能源物質，利用該菌株游離細胞對3?羥基丙腈進行轉化實驗，能將500mM 3?羥基丙腈完全轉化，3?羥基丙酸累積濃度可達到216.3mM。季也蒙畢赤酵母CGMCC 12935具有生命力強、腈轉化能力突出等特點，為3?羥基丙酸的合成建立了一種新工藝；本工藝具有反應條件溫和、能耗低、環境友好等特點。

技術領域

本發明屬于工業生物技術領域，特別涉及一種腈水解酶產生酵母菌的篩選方法及其在腈類化合物生物轉化制備3-羥基丙酸中的應用。

背景技術

腈水解酶能將腈類底物中的腈基轉化為羧基從而制備得到有機酸、氨基酸等化合物，在大宗化學品、食品添加劑和醫藥中間體等領域具有重要應用。自1964年Robinson等人首次從土壤中分離到一株產蓖麻堿腈水解酶的假單胞菌屬Pseudomonas菌株以來，不同來源的腈水解酶已經得到廣泛研究，日本學者采用紅球菌Rhodococcus rhodochrous J1產腈水解酶，可水解多種腈類化合物制備得到有機酸。自此，不同來源的腈水解酶產生菌逐漸見諸報道，包括紅球菌屬Rhodococcus，諾卡氏菌屬Nocardia，不動桿菌屬Acinetobacter，產堿桿菌屬Alcaligenes，假單胞菌屬Pseudomonas，短根瘤菌屬Bradyrhizobium，叢毛單胞菌屬Comamonas，芽胞桿菌屬Bacillus，火球菌屬Pyrococcus，鹽單胞菌Halomonas，節桿菌屬Arthrobacter，嗜熱芽胞菌Geobacillus，棒狀桿菌Corynebacterium等各種不同來源的細菌；鐮刀菌Fusarium，曲霉Aspergillus和青霉菌Penicillium等來源的真菌。這些文獻報道的利用腈水解酶獲得的化合物包括煙酸、扁桃酸、丙烯酸、羥基乙酸、亞氨基二乙酸以及多種非天然氨基酸等。這些報道中，以細菌來源的腈水解酶為主，而真菌腈水解酶則相對報道較少，尤其是來源于酵母菌的腈水解酶更是鮮有報道。

3-羥基丙酸，是一種三碳無手性化合物，具有羥基和羧基兩個官能團，與乳酸互為同分異構體，是很多光學活性物質的前體；作為一種重要平臺化合物，被用于眾多醫藥化工產品的生產中，是合成大分子化合物和聚合物的重要單體。2004年美國能源部將3-羥基丙酸列為當今世界12種最具開發潛力的化工產品之一，具有重要的開發價值，近年來也逐步受到關注。3-羥基丙酸的傳統生產方法主要通過化學法進行。一般利用氰化鉀與鄰鹵代醇反應，生成3-羥基丙腈，再通過Reformatsky反應生成3-羥基丙酸；在高溫下，丙烯酸可發生水合反應合成3-羥基丙酸；此外，也可利用鉑金和一種固體酸催化劑ZSM5zeolite分別催化3-羥基丙醛和丙烯酸生成3-羥基丙酸；總結來看，化學法合成步驟相對復雜，對設備要求高，且產品分離純化流程繁瑣，生產成本相應較高。

近年來發展的生物法中利用微生物發酵生產3-羥基丙酸，則可有效避免化學合成法所帶來的不利因素，且具有原料來源豐富，綠色環保，生產成本低等優勢。結合基因工程手段可以較好實現3-羥基丙酸的生產。利用基因工程菌株生產3-羥基丙酸的方法按照底物的不同主要包括兩類：一類是以谷物類碳水化合物葡萄糖為底物；一類是以三碳化合物甘油為底物。而在野生菌生產3-羥基丙酸的研究中，如1，3-丙二醇、丙酸、丙烯酸、3-氨基丙酸等作為底物均有報道。但生物發酵法需要輔酶參與，并且產率和產物純度不高，同時菌體對高濃度底物耐受能力偏低。利用腈水解酶一步催化腈類物質3-羥基丙腈制備3-羥基丙酸是一種可替代性技術，該方法步驟簡單，避免了中間產物的影響，而且該工藝具有反應條件溫和、能耗低、環境友好等技術優勢。迄今為止，尚未見酵母屬菌株，尤其是季也蒙畢赤酵母Meyerozyma guilliermondii產腈水解酶用于3-羥基丙酸合成的報道。