[發明專利]用于志賀氏菌及四環素耐藥基因的RPA快速檢測的引物

有效

• 申請號: 201710126445.8
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN107058514B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 曲道峰;韓劍眾;徐琳;沈楊;張恩寶
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 朱亞冠

本發明公開用于志賀氏菌及四環素耐藥基因的RPA快速檢測的引物。本發明設計的引物具有較好的種間特異性和種內保守性，該反應能特異性檢測出目標基因并同時能分別鑒定志賀氏菌(褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌)及四環素耐藥基因(tetM)，而避免假陽性的出現；本發明根據四環素耐藥基因(tetM)設計了一對特異性引物，根據褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌基因的同源性設計了一對引物，因此2對引物可以擴增出3條目的基因，與傳統方法比較，引物數量大為減少(傳統方法擴增3條目的基因需要3對引物)，從而減少了假陽性的出現。擴增后片段長度大小各異，可通過電泳進行分開辨別。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種快速檢測志賀氏菌及四環素耐藥基因的重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的引物及其應用，具體涉及一種可在樣品中同時檢測出褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌、四環素耐藥基因(tetM)的RPA快速檢測的引物。

背景技術

志賀氏菌病(Shigellosis)又稱細菌性痢疾，是志賀菌屬痢疾桿菌(褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌等)引起的一種急性腸道傳染病，具有高度傳染性和嚴重危害性，主要易感人群為5歲以下兒童和免疫障礙人群。痢疾感染患者常有腹痛、腹瀉、粘液性膿血便、發熱，嚴重患者還可能伴隨有腎臟衰竭和神經毒性等危及生命的癥狀，嚴重危害人類的健康和生命安全。而且，如今抗生素的大量濫用，導致各類食源性病原菌的耐藥菌株日益增多，四環素類抗生素作為一類廣譜抗生素，因其價格低廉、作用范圍廣泛、毒性低等優點，曾廣泛地應用于畜禽抗菌促生長劑和人醫、獸醫和植物細菌性感染的防治，導致許多細菌都對其產生嚴重的耐藥性。志賀氏菌作為人獸共患病原菌，目前已產生了嚴重的耐藥性，尤其對四環素耐藥性較多。大量耐藥菌株的存在和流行，使得本病的發病率和死亡率都不斷上升，引起世人的廣泛關注。因此亟需建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性都較高的現代化檢測志賀氏菌的方法。而目前，志賀氏菌的快速檢測方法主要有常規檢測法、快速生化儀器檢測法、分子生物學檢測方法、毒素檢測法、環介導恒溫擴增技術和酶聯免疫檢測法等，但因它們操作程序復雜、檢測時間長、耗資大、準確度不高且特異性差，很難適應現代化食品安全快速檢測的需要。所以我們需要努力找到一種更好的快速檢測方法來代替它們。

重組酶聚合酶擴增技術(RPA)作為近年來開發的核酸擴增技術，相比經典PCR技術，RPA技術主要優勢之一在于等溫。常規PCR必須經過不同溫度環節，而RPA反應在常溫下即可進行反應。優勢之二在于檢測耗時短。整個過程在10-20分鐘內即可完成，且無需變性。優勢之三在于靈敏。RPA技術在縮短反應時間的同時也保持了高靈敏性。優勢之四在于結果讀取多樣化。RPA結果可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，也可類似real-time PCR對擴增過程進行實時監控，還可以通過試紙條讀取結果。

本方法采用RPA技術對樣品中褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌及四環素耐藥基因(tetM)進行研究，在保證靈敏、特異的同時，操作簡單、耗時短，能夠在常溫下10～20分鐘內對靶DNA進行擴增，在檢測志賀氏菌(褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌)的同時也可檢測四環素耐藥基因(tetM)。對耐四環素志賀氏菌的分子流行病基礎提供理論基礎和科學依據，在獸醫、食品衛生和公共衛生等方面具有重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種可同時檢測褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌及四環素耐藥基因(tetM)的RPA快速檢測的引物序列。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下：

為實現上述目的，本發明根據志賀氏菌(褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌)及四環素耐藥基因(tetM)的特征靶基因設計出2對特異性引物F1/R1、F2/R2，見表1，其中褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌共用一對引物F1/R1。各特異性引物具有高度種內保守、種間特異性等優點。擴增后片段長度大小各異，褔氏志賀氏菌擴增后產物大小為186bp，宋內氏志賀氏菌擴增后產物大小為253bp，四環素耐藥基因(tetM)擴增后產物大小為534bp，可通過電泳進行分開辨別。