[發明專利]用于志賀氏菌及四環素耐藥基因的RPA快速檢測的引物

有效

• 申請號: 201710126445.8
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN107058514B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 曲道峰;韓劍眾;徐琳;沈楊;張恩寶
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 朱亞冠

1.用于志賀氏菌(Shigella Castellani)及四環素耐藥基因的RPA快速檢測的引物，其特征在于包括兩對特異性引物，具體是：

F1: 5’- GACAGGGATATATTATCTGGCGCCAGTTTATT -3’；

R1: 5’- GATTAGCGACCAAAAAGGAGCCTTAAGAAAGA -3’；

F2: 5’- GAGGACGGATAATACGCTTTTAGAACGTCAGA -3’；

R2: 5’- CCGTGATAAACAGGGAACAGGGAACAATTATG -3’。

2.如權利要求1所述的用于志賀氏菌及四環素耐藥基因的RPA快速檢測的引物，其特征在于擴增后目的片段長度大小各異，褔氏志賀氏菌(Shigella flexneri)擴增后產物大小為186 bp，宋內氏志賀氏菌(Shigella sonnei)擴增后產物大小為253 bp，四環素耐藥基因tetM擴增后產物大小為534 bp，可通過電泳進行分開辨別。

3.如權利要求2所述的用于志賀氏菌及四環素耐藥基因的RPA快速檢測的引物，其特征在于用于褔氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌及四環素耐藥基因tetM檢測時包括以下步驟：

步驟(1).樣品前處理

取樣25 g，加入225 mL 滅菌的蒸餾水，用組織勻漿機均質1 min，得到組織勻漿樣品；

步驟(2).樣品DNA提取

取50 mg步驟（1）處理后的組織勻漿樣品，加入200 μl pH值為8.0 的TE緩沖溶液，渦旋混勻；加入400 μl裂解液，混勻后加600 μl酚-氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000 g離心10 min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000 g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿，劇烈振蕩，12000 g離心10 min；取上清液，加入為該上清液0.8倍體積的異丙醇，12000 g離心l0 min；取沉淀，用體積含量為70﹪的乙醇清洗1次，再在常溫或50℃下晾干20 min，然后加入80 μl pH值為8.0 的TE緩沖溶液溶解，得到DNA提取物；該DNA提取物即為模板DNA；將DNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；

所述的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑由酚、氯仿、異戊醇按照體積比25：24：1混合而成；

所述的氯仿-異戊醇混合溶劑由氯仿、異戊醇按照體積比24：1混合而成；

所述的TE緩沖液為1 ml 濃度為1 M 、pH值為 8.0的Tris-Cl，0.2 ml濃度為 0.5 M、pH值為 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液；

所述的裂解液為Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉SDS組成的混合液，其中Tris-HCl的濃度為50 mM、 pH值為 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的濃度為25mM，NaCl的濃度為100 mM，蛋白酶K的濃度為20 μg/μL，十二烷基硫酸鈉SDS的質量分數為10﹪；

步驟(3).RPA擴增

將RPA擴增反應體系振蕩混勻后，進行RPA擴增,得到擴增產物；

所述的RPA擴增反應體系即RPA 凝膠檢測體系為50 μL由含有凍干酶粉的0.2 mlTwistAmp Basic 反應管中加入再水化緩沖液（Rehydration Buffer）29.5 μL，去離子水11μL，混合引物6 μL（10 μmol/L），提取的樣品基因組 DNA 1μL，醋酸鎂溶液2.5 μL（280mmol/L）組成；

將RPA擴增反應體系振蕩混勻后，放入37℃恒溫金屬浴反應 25 min，得到擴增產物；

所述的加入的混合引物為2對特異性引物的混合引物，其中2對特異性引物的濃度比為F1:R1:F2:R2=2:2:1:1；

步驟(4).擴增產物電泳檢測

反應結束后，取擴增產物2～3 μL，于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，根據凝膠成像系統成像得到相應的電泳條帶判斷結果。

4.如權利要求3所述的用于志賀氏菌及四環素耐藥基因的RPA快速檢測的引物，其特征在于所述的樣品為豬肉或雞肉。