[發明專利]一種用于檢測口蹄疫的環介導等溫擴增引物組及試劑盒

在審

• 申請號: 201710124594.0
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106636476A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 張薇;王耕;王振超;陳安東
• 申請（專利權）人: 張薇
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司11471
• 代理人: 王金寶

技術領域

本發明屬于領域屬于口蹄疫病毒檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測口蹄疫的環介導等溫擴增引物組及試劑盒。

背景技術

口蹄疫(Food and mouth disease virus，FMD)是由口蹄疫病毒(Food And Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一種急性高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄動物，如牛、豬、羊等；其特征是發熱、皮膚或粘膜發生水潰瘍，尤其是在口腔和蹄叉部位。

口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，約有8500個核苷酸組成。病毒基因組有一個開放性閱讀框(ORF)、一個5’端非編碼區(NCR)和3’端非編碼區(NCR)組成，ORF編碼由4中結構蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)、RNA聚合酶(3D)、蛋白酶(L、2A、3C)以及其他非結構蛋白(如3A等)組成。口蹄疫病毒包括7個血清型和60余個亞型，7個血清型為：O型、Asia I型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型，并且各血清之間無交叉免疫反應。

口蹄疫在亞洲主要流行有A型、O型、C型、Asia I型4個血清型，截止目前，我國僅見O型、亞洲I型、A型三個血清型的口蹄疫。但是非洲型和C型出現在我國周邊國家中，對我國威脅較大。因此建立快速、準確、靈敏、特異的現場檢測方法對口蹄疫的預防與控制具有重大意義。

目前檢測口蹄疫的方法有間接夾心酶聯免疫吸附試驗、反向間接血凝試驗、中和試驗、液相阻斷酶聯免疫吸附試驗、非結構蛋白ELISA檢測、正向間接血凝試驗等。但這些方法都依賴檢測相應的抗體，屬于血清學檢測方法。另一種方法是病源生物學方法，并且這種方法耗費時間長，并且對試劑樣本有一定依賴性。由于口蹄疫病毒高度變異性和交叉性，其特異性難以保證，容易出現假陽性和假陰性。。

專利申請號為200810034124、201210221684和201310067020的發明專利分別提供了O型、C型和7種血清型分型的環介導等溫擴增快速檢測試劑盒，相對于PCR或血清學檢測方法，靈敏度高，檢測快。但是，發明專利200810034124和201210221684中提供的試劑盒只能檢測到樣本是否為O型或C型口蹄疫病毒，對于其他血清型口蹄疫病毒則呈現出陰性結果。而發明專利201310067020提供了7種血清型分型的試劑盒，但是在7個反應管中，每個管中單獨檢測一種類型血清型。其制造成本和使用成本相對較大，嚴重限制了其在現場實際應用價值。

發明內容

為了解決現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種能夠快速、準確、靈敏的檢測大型畜牧動物是否感染口蹄疫病毒的環介導等溫擴增引物組及試劑盒。

本發明所采用的技術方案為：一種用于檢測口蹄疫的環介導等溫擴增引物組，包括內引物1、內引物2、外引物1、外引物2、環引物1和環引物2，所述內引物1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述內引物2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述外引物1的序列如SEQ ID NO：3所示，所述外引物2的序列如SEQ ID NO：4所示，所述環引物1的序列如SEQ ID NO：5所示，所述環引物2的序列如SEQ ID NO：6所示。

SEQ ID NO：1的序列為：TTCCGCAAATAGCAGCAG；

SEQ ID NO：2的序列為：CTGGAGCTATGCTTTATGC；

SEQ ID NO：3的序列為：TGGTGTGAGTCTCCACGTCAACGAACACAATCGACGTACTGT；

SEQ ID NO：4的序列為：TCTCCTACGGCGACGAGTTCGGAAGCAAGGGATGATACC；

SEQ ID NO：5的序列為：TCACGGTGCTTGAGCTAAGAC；

SEQ ID NO：6的序列為：GGTTGCAAGTGCGTACGTGGAG；

本發明還提供了一種含有所述環介導等溫擴增引物組的試劑盒，所述試劑盒還包括反應液，所述反應液包括反應濃縮液和逆轉錄酶；所述反應濃縮液包括DNA聚合酶，酶緩沖液，dNTP，MgSO₄，甘氨酸三甲胺內鹽和熒光染料。

所述試劑盒能夠快速、準確、靈敏的檢測大型畜牧動物是否感染口蹄疫病毒。

使用所述試劑盒檢測口蹄疫病毒的方法，包括以下步驟：

(1)病毒RNA提取：采集疑似感染口蹄疫病毒的牲畜的血清，提取樣本RNA并逆轉錄為cDNA作為樣品；