[發明專利]多重實時熒光PCR檢測Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因的方法

有效

• 申請號: 201710123825.6
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106702008B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 廖騏;丁春連;柴立元;楊志輝;閔小波;顏旭;唐崇儉;王海鷹;楊衛春;李青竹
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明提供多重實時熒光PCR檢測Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因的方法，所述復合菌群包含保藏編號為CGMCC No.3052的Pannonibacter phragmitetus BB菌、保藏編號為ATCC No.700550的Shewanella oneidensis MR?1菌和保藏編號為ATCC No.700007的Pseudomonas putida F1菌。所述六種功能基因為BB菌的Cr(VI)還原功能基因HcrR、MR?1菌的Cr(VI)還原酶基因OmcA、F1菌的Cr(VI)還原酶基因ChrR，以及上述三種菌的16s rDNA基因。本發明提供了一種操作簡單、快捷，成本低廉的多重熒光PCR技術檢測六種功能基因表達動態變化的方法，檢測方法靈敏性和特異性高，檢測結果準確。

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體地說，涉及多重實時熒光PCR檢測Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因的方法。

背景技術

在重金屬污染中Cr(VI)因其毒性大、氧化性強以及致癌性高，對人類和動植物的生命安全造成了非常大的威脅，其中Cr(VI)土壤污染問題最突出。據統計，我國受Cr(VI)嚴重污染的土壤面積就高達500萬平方米，污染土方量約1500萬立方。因此，對我國Cr(VI)污染土壤進行合理有效的修復已經迫在眉睫。

目前微生物還原Cr(VI)成為Cr(VI)污染土壤修復的熱點。以Pannonibacterphragmitetus BB為主，Shewanella oneidensis MR-1和Pseudomonas putida F1的復合Cr(VI)還原菌群可以克服溫度、pH、有機污染物和重金屬等諸多環境因素的影響，增強還原群落剛性，提高還原效率，是目前較為高效的Cr(VI)土壤的修復方法之一。但是，傳統方法在復合菌群中無法檢測單一菌株的生理生長狀態和Cr(VI)還原基因的表達，嚴重阻礙了菌群Cr(VI)還原協同機理的研究以及中試和場地微生物修復工程中菌群配方的調控。因此，亟需開發一種新的基于核酸水平的檢測方法。

對于復合菌群中微生物，Naoki M.等(Fukuma N M,Koike S,KobayashiY.Monitoring of gene expression in Fibrobacter succinogenes S85 under the co-culture with non-fibrolytic ruminal bacteria.[J].Archives of Microbiology,2015,197(2):269-276.)采用16s rDNA的拷貝數和16s rRNA/rDNA的比值分別表示瘤胃中復合微生物的生長狀況與代謝活性。針對基因表達的檢測，常規的方法主要有Northernblotting、in situ hydridisation、RNAse protection assays、cDNA arrays和reversetranscription real-time polymerase chain reaction(RT-qPCR)。Northern blotting雖然可檢測目的RNA的大小，但其操作繁瑣，耗時耗力；in situ hydridisation操作復雜；RNAse protection assays主要適用于繪制轉錄起始和終止位點以及內含子/外顯子邊界，以及用于區分相似大小的相關mRNA，對于表達的定量并不適用；cDNA arrays成本高，適用性有限。以上技術還有一個共同的缺點：敏感性低，對于微量的mRNA無法有效的檢測。RT-qPCR是用于檢測目的基因表達量的最敏感和最靈活的方法，可用于比較不同樣本群體中mRNA的水平檢測，表征mRNA表達模式，區分密切相關的mRNA以及分析RNA結構。但是針對單一基因的RT-qPCR，一次只能檢測一種基因的表達，同時又存在操作繁瑣、費時費力等缺點，尤其是需要同時檢測多個基因的情況時。為了探明菌株之間的相互影響，必須要涉及到同時檢測多個基因，多重RT-qPCR技術可以實現同時檢測多個基因，同時具有高特異性和敏感性、檢測時間短、檢測成本低等優點，是一種較為理想的檢測方法。