[發明專利]多重實時熒光PCR檢測Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因的方法

有效

• 申請號: 201710123825.6
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106702008B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 廖騏;丁春連;柴立元;楊志輝;閔小波;顏旭;唐崇儉;王海鷹;楊衛春;李青竹
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.用于多重實時熒光PCR檢測Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因的引物組合，其特征在于，包括：

用于擴增保藏編號為CGMCC No.3052的Pannonibacter phragmitetus BB菌的Cr(VI)還原功能基因HcrR及其核蛋白體核糖核酸16s亞基基因16s rDNA-BB的引物，用于擴增保藏編號為ATCC No.700550的Shewanella oneidensis MR-1菌的Cr(VI)還原酶基因OmcA及其核蛋白體核糖核酸16s亞基基因16s rDNA-MR-1的引物，用于擴增保藏編號為ATCCNo.700007的Pseudomonas putida F1菌的Cr(VI)還原酶基因ChrR及其核蛋白體核糖核酸16s亞基基因16s rDNA-F1的引物；

引物序列如下：

HcrR-F：5'-GGGACAACTACACCGCAGAC-3'

HcrR-R：5'-AGCCAGAGCGATGCCGAA-3'

OmcA-F：5'-ATTGGCTATGGCGGTAAGGTA-3'

OmcA-R：5'-AACAGATCGGCATTAGCAGGT-3'

ChrR-F：5'-CAAGCTCAATGACAAGACG-3'

ChrR-R：5'-GCCCTGTTCAACTTCACCCAT-3'

16s rDNA-BB-F：5'-TTCACAACACGAGCTGACGA-3'

16s rDNA-BB-R：5'-CAACGCGAAGAACCTTACCT-3'

16s rDNA-MR-1-F：5'-ACGTGCTACAATGGCGAGTA-3'

16s rDNA-MR-1-R：5'-TTCATGGAGTCGAGTTGCAG-3'

16s rDNA-F1-F：5'-CGCGTGTGTGAAGAAGGTCT-3'

16s rDNA-F1-R：5'-CACAGAGTTAGCCGGTGCTT-3'。

2.含有權利要求1所述引物組合的用于多重實時熒光PCR檢測Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因的試劑盒。

3.多重實時熒光PCR檢測Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因的方法，其特征在于，基于多重實時熒光PCR檢測技術，利用權利要求1 所述引物組合或權利要求2所述試劑盒對Cr(VI)還原復合菌群六種功能基因進行多重實時熒光PCR檢測。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，包含兩個PCR反應體系，其中一個體系用于檢測Pannonibacter phragmitetus BB菌的Cr(VI)還原功能基因HcrR、Shewanellaoneidensis MR-1菌的Cr(VI)還原酶基因OmcA及Pseudomonas putida F1菌的Cr(VI)還原酶基因ChrR，另一個體系用于檢測上述三種菌的核蛋白體核糖核酸16s亞基基因。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測樣品的總RNA，反轉錄成cDNA；

2)以上述cDNA為模板，分兩管進行實時熒光定量PCR擴增；

3)分析PCR擴增產物。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)其中一個管的PCR擴增體系為：2×FastStart Essential DNA Green Master 25μL，HcrR、OmcA、ChrR各基因上下游引物的終濃度分別為0.05μM、0.2μM、0.2μM，cDNA模板1μL，RNase/DNase Free dH₂O至總體積50μL；

另一個管的PCR擴增體系為：2×FastStart Essential DNA Green Master 25μL，16srDNA-BB、16s rDNA-MR-1、16s rDNA-F1各基因上下游引物的終濃度分別為0.2μM、0.1μM、0.2μM，cDNA模板1μL，RNase/DNase Free dH₂O至總體積50μL。