[發(fā)明專利]一種低成本的BCR/ABL融合基因快速檢測探針及其制備方法和應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710123224.5 | 申請日： | 2017-03-03 |
| 公開（公告）號： | CN106834492B | 公開（公告）日： | 2018-06-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李倩;李雪梅;葉倫;程弘夏;陳剛 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6886 | 分類號： | C12Q1/6886;C12Q1/6811;C12Q1/6841;C12N15/11;C12N15/10;G06F19/20 |
| 代理公司： | 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102 | 代理人： | 鄔麗明;徐曉琴 |
| 地址： | 430075 湖北省武漢市*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 探針 快速檢測 制備 低成本 分子生物學(xué)領(lǐng)域 制備方法和應(yīng)用 非重復(fù)序列 標(biāo)簽序列 標(biāo)簽引物 覆蓋區(qū)域 探針設(shè)計 熒光基團(tuán) 雜交實驗 雜交信號 直接合成 基因組 信噪比 再使用 擴(kuò)增 下載 明亮 雜交 分割 | ||
1.一種低成本BCR/ABL融合基因快速檢測探針的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）從UCSC Genome Browser下載BCR和ABL基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列，其中BCR探針覆蓋區(qū)域為：chr22 22806485~23854431，ABL探針覆蓋區(qū)域為：chr9130396674~131075953；
（2）將步驟（1）獲得的BCR基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導(dǎo)入OligoArray 軟件進(jìn)行探針設(shè)計、探針篩選，然后將篩選出的探針導(dǎo)出到EXCEL表格中，再分別在每條探針的5’端加上17bp的標(biāo)簽序列、3’端加上18bp的標(biāo)簽序列，得到一系列帶有標(biāo)簽序列的BCR探針序列；所述探針篩選的條件為：探針長度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探針間最小間隔5bp；所述標(biāo)簽序列的堿基序列如下所示：5’端標(biāo)簽序列為：TGTAAAACGACGGCCAG，3’端標(biāo)簽序列為：GGTCATAGCTGTTTCCTG；
（3）將步驟（1）獲得的ABL基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導(dǎo)入OligoArray 軟件進(jìn)行探針設(shè)計、探針篩選，然后將篩選出的探針導(dǎo)出到EXCEL表格中，再分別在每條探針的5’端加上17bp的標(biāo)簽序列、3’端加上18bp的標(biāo)簽序列，得到一系列帶有標(biāo)簽序列的ABL探針序列；所述探針篩選的條件為：探針長度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探針間最小間隔5bp；所述標(biāo)簽序列的堿基序列如下所示：5’端標(biāo)簽序列為：TGTAAAACGACGGCCAG，3’端標(biāo)簽序列為：GGTCATAGCTGTTTCCTG；
（4）使用DNA合成儀對步驟（2）所得帶有標(biāo)簽序列的BCR探針序列進(jìn)行化學(xué)合成，將化學(xué)合成的探針進(jìn)行混合，制備得到BCR探針庫；同理，使用DNA合成儀對步驟（3）所得帶有標(biāo)簽系列的ABL探針序列進(jìn)行化學(xué)合成，將化學(xué)合成的探針進(jìn)行混合，制備得到ABL探針庫；
（5）分別合成5’端帶有綠色熒光基團(tuán)的M13通用引物和5’端帶有橘紅色熒光基團(tuán)的M13通用引物，使用5’端帶有綠色熒光基團(tuán)的M13通用引物對BCR探針庫進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)，使用5’端帶有橘紅色的熒光基團(tuán)的M13通用引物對ABL探針庫進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)；所述通用引物的序列如下所示：M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-R CAGGAAACAGCTATGACC；
（6）將步驟（5）所得BCR探針庫的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物純化、稀釋后即得到熒光標(biāo)記的BCR探針庫， 將步驟（5）所得ABL探針庫的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物純化、稀釋后即得到熒光標(biāo)記的ABL探針庫，所述熒光標(biāo)記的BCR探針庫和熒光標(biāo)記的ABL探針庫構(gòu)成了BCR/ABL融合基因快速檢測探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟（5）所述擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)的PCR反應(yīng)
體系如下：
2×PCR Mix 25μL
模板 50ng
M13-F 1μL
M13-R 1μL
H2O 補足至50μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟（5）所述擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)的PCR反應(yīng)條件如下：95℃5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，共進(jìn)行35個循環(huán)；72℃10min。
4.一種包含權(quán)利要求1~3任一所述制備方法制備所得BCR/ABL融合基因快速檢測探針的BCR/ABL融合基因檢測試劑盒。
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