[發明專利]灰霉病菌對QoIs殺菌劑抗性風險的快速評定方法

在審

• 申請號: 201710122876.7
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106755538A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 張傳清;胡小然;時浩杰;戴德江
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及環介導等溫擴增技術檢測含有BCbi143/144內含子灰霉病菌的環介導等溫擴增(LAMP)引物組及其使用方法，屬于植物病害檢測、鑒定、防治及病原菌抗藥性風險預警的技術領域。

背景技術

灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)屬于半知菌類絲孢綱絲孢目葡萄孢屬，是一條件致病菌，腐生性強，屬壞死型植物病原真菌，具有潛伏侵染的特點，潛伏期較長?；移咸焰叩募闹鲗；圆粡?，寄主范圍廣，可侵染230多種植物，不同寄主植物間的灰葡萄孢可交互侵染，因而很難像專性寄生菌那樣發現有效的抗病材料，故而很難培育出抗病品種。

灰霉病菌因具有寄主范圍廣、繁殖快和遺傳變異頻繁等特點，使其極易對殺菌劑產生抗性。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(QoIs)是一類來源于具有殺菌活性的天然抗生素strobilurinA的新型殺菌劑，包括嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯等藥劑，具有廣譜高效的抗菌活性。由于其具有獨特的作用靶標，與其它現有的殺菌劑不存在交互抗性。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用于真菌線粒體呼吸鏈上的復合體III，通過與細胞色素b基因編碼的cytb的Qo位點結合來抑制呼吸鏈上的電子傳遞，進而影響呼吸作用阻礙病原真菌的合成，干擾細胞正常分裂和生長，進而造成菌體死亡。

從1996年歐洲開始使用甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑防治小麥白粉病到現在，灰霉病菌對嘧菌酯等QoI藥劑產生了明顯的抗藥性。據報道，CYTB上的點突變G143A，F129L和G137R可以引起灰霉病菌對QoI藥劑不同水平的抗藥性，但是，灰霉病菌田間抗性的產生主要是因為點突變G143A，藥劑壓力可以提高G143A突變基因的頻率，而且該點突變引起的抗性水平穩定。研究表明灰霉病菌中存在2種類型的cyt b基因：Ⅰ型cyt b基因在第143位密碼子后緊跟內含子；Ⅱ型cyt b基因在第143位密碼子后沒有緊跟內含子?；颐共【鷮oI藥劑產生抗性的機制主要是菌株的cyt b基因的第143位密碼子由甘氨酸(GGC)突變為了丙氨酸(GCC)，即抗藥性機制為cyt b基因的G143A點突變。

QoI藥劑是目前市場占有率最高的一類殺菌劑，但是容易抗藥性是其面臨的主要問題。一旦產生抗藥性，藥劑的防治效果就會顯著降低甚至完全失效。農民就會不斷提高藥劑的使用劑量，不但防治效果不佳，用藥量過高后還可能帶來農產品安全和環境安全問題。因此，在防治灰霉病時，在施藥前如果能快速確定該地的灰霉病菌是否對QoI藥劑容易產生抗藥性，對于指導科學用藥具有十分重要的意義。而普通的生物測定技術或者PCR等分子生物學技術都不能達到這一要求，生物測定技術需要的時間很長(至少1周以上)、工作量達；PCR等分子生物學技術不但需要昂貴的儀器設備還需要熟練的高級技術操作人員。且目前的生物測定技術或者PCR等分子生物學技術都是用于時候測定病菌對藥劑的抗性狀況。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是于2000年由Notomi等首次發明、報道的一種新型、方便快捷、靈敏度極高且廉價的核酸擴增方法。其特點是針對靶基因的個區域設計條特異性引物，在鏈置換DNA酶(Bst DNA polymerase)的作下，60～65℃恒溫擴增，60min左右即可觀察結果，具有操作簡單、快速、特異性強、產檢測便捷等特點。在反應液中添加適當的染料和金屬離子，通過指示反應液顏色變化來判斷反應結果，加入HNB(羥基萘酚藍)，在日光燈下通過肉眼即可觀察到顏色變化，陽性反應結果會由藍紫色變成天藍色。從擴增原理可知，擴增過程中會產生大量大小不一的片段(即莖環DNA、若干倍莖長度的莖環結構和類似花椰菜的結構)，當用的瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳檢測時，會出現一系列呈梯狀的電泳條帶。因此，可以利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，來判斷是否進行擴增。待測樣品為陽性時，會出現呈梯狀的電泳條帶，反之，不出現呈梯狀的電泳條帶。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種灰霉病菌對QoIs殺菌劑抗性風險的快速評定方法，即，一種用于檢測含有BCbi143/144內含子灰霉病菌的環介導等溫擴增方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種用于檢測含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌的環介導等溫擴增(LAMP)引物，該LAMP引物組合物由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物TB3，SEQ ID NO.3所示的正向內引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向內引物BIP組成；