[發明專利]灰霉病菌對QoIs殺菌劑抗性風險的快速評定方法

在審

• 申請號: 201710122876.7
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106755538A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 張傳清;胡小然;時浩杰;戴德江
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 金祺

1.用于檢測含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌的環介導等溫擴增引物，其特征在于：LAMP引物組合物由以下4條引物組成：

F3：CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT；

TB3：CGTACAGTAACCATGGGATA；

FIP：TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG；

BIP：CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT。

2.用于檢測含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌的環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于：包含如權利要求1所述的LAMP引物組合物。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：LAMP引物組合物的濃度為：1.6μM的正內向引物FIP，1.6μM的反向內引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于：試劑盒還包含：10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜堿、羥基萘酚藍、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

5.用于檢測含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌的環介導等溫擴增方法，其特征在于：25μL反應體系由以下成分組成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿4.0μL、3.75mM羥基萘酚藍1μL、DNA模板1μL，ddH₂O補足至25μL。

6.根據權利要求5所述的環介導等溫擴增方法，其特征在于：

利用所述25μL檢測反應體系進行LAMP擴增反應，擴增結果的分析和判定方法為選擇以下任一：

方法一、先在擴增前加入染料羥基萘酚藍作為反應指示劑，以羥基萘酚藍的顏色變化做為結果判定標準，然后進行LAMP擴增反應，反應結束后，顏色發生變化，即顯色結果為天藍色判斷為陽性，即顯示檢測到含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌；顏色沒有發生變化，顯色結果仍為藍紫色判斷為陰性，即顯示樣品無含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌，或所含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌含量未達檢測限；

方法二、取5μL擴增產物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現梯形條帶判斷為陽性，即顯示檢測到含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌；無擴增條帶則判斷為陰性，即顯示無含有BCbi143/144內含子的灰霉病菌，或所含的有BCbi143/144內含子的灰霉病菌未達檢測限。

7.根據權利要求6所述的環介導等溫擴增方法，其特征在于LAMP擴增反應程序為：65℃擴增60min；80℃滅活10min。

8.根據權利要求7所述的環介導等溫擴增方法，其特征在于：所述方法一、方法二中的檢測限DNA濃度為1pg/μL。