[發(fā)明專利]液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢普可尼亞菌孢子的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710121569.7
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106701655A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 豐來;譚石勇;譚武貴;羅志威;徐滔明;鄭雙鳳;張冬雪;邱堯
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南泰谷生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京紐樂康知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11210
• 代理人: 羅莎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢普可尼亞菌孢子的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)

植物根結(jié)線蟲是一種高度專化型的雜食性植物病原線蟲，是引起農(nóng)作物減產(chǎn)的主要病害之一。防治根結(jié)線蟲的方法，主要包括化學(xué)防治、物理防治、抗病品種篩選及生物防治。目前線蟲防治主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治不但生產(chǎn)成本較高，且毒性大，易污染環(huán)境，對人畜健康造成威脅，而物理防治效果不顯著，抗病品種篩選則周期過長，因此，安全、高效的生物防治成為近年來國內(nèi)外研究植物線蟲防治的熱點(diǎn)。根結(jié)線蟲生防資源主要包括食線蟲真菌、細(xì)菌、放線菌等，其中厚垣孢普可尼亞菌是國內(nèi)外研究最多的線蟲生防真菌之一。

厚垣孢普可尼亞菌（Pochoniachlamydosporia）屬于真菌界，子囊菌門，子囊菌亞門，糞殼菌綱，肉座菌目，麥角菌科，普可尼亞屬，是一種兼性寄生菌。研究表明，厚垣孢普可尼亞菌既可在土壤中腐生,又能寄生于多種致植物病的線蟲的雌蟲、胞囊、卵囊或蟲卵內(nèi)，對植物寄生線蟲具有較大的生防潛力。此外，厚垣孢普可尼亞菌對植物不具有致病性，因此，其在植物寄生線蟲的生防上有著巨大的開發(fā)應(yīng)用前景。

目前，國內(nèi)還沒有公開的專利涉及液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢普可尼亞菌孢子，相關(guān)發(fā)酵研究也較少，且現(xiàn)有方法普遍存在孢子含量低，發(fā)酵周期長等問題。如張虹等利用草炭、麥粒、玉米粉等發(fā)酵厚垣孢普可尼亞菌，15天后，其孢子總產(chǎn)量最高60×10⁶個/g。邢麗娟以馬鈴薯塊為主要基質(zhì)發(fā)酵厚垣孢普可尼亞菌，3周后孢子總產(chǎn)量才達(dá)18.75×10⁴ /mL。蘇瑩珍等采用玉米-沙石培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)菌株284，培養(yǎng) 3 周后，厚垣孢子產(chǎn)量達(dá)1.00×10⁶個/g。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢普可尼亞菌孢子的方法，旨在利用廉價原材料高產(chǎn)厚垣孢普可尼亞菌孢子，降低厚垣孢普可尼亞菌菌劑生產(chǎn)成本，縮短發(fā)酵周期，為建立規(guī)模化的發(fā)酵工藝提供參考依據(jù)。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢普可尼亞菌孢子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

a菌種活化：活化厚垣孢普可尼亞菌菌種，得到活化后的孢子懸液；

b搖瓶種子液制備：將活化后的孢子懸液按體積比8-10%的接種量接種于已滅菌的搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，得到搖瓶種子液；

c液體發(fā)酵：將搖瓶種子液按照體積比8-15%的接種量接種于已滅菌的發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到液體發(fā)酵產(chǎn)物；

d固體發(fā)酵產(chǎn)孢：將液體發(fā)酵產(chǎn)物按照質(zhì)量比20-25%的接種量接種于已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行淺盤固體發(fā)酵，得到厚垣孢普可尼亞菌孢子。

上述方法中，步驟a中活化厚垣孢普科尼亞菌菌種方法為：將厚垣孢普可尼亞菌接種于PDA茄型瓶斜面上，28℃培養(yǎng)5-7天，用100 mL無菌生理鹽水反復(fù)沖洗活化好的菌株斜面，得到活化后的孢子懸液；

步驟b中搖瓶培養(yǎng)條件：溫度25-28℃，搖床轉(zhuǎn)速100-120 r/min，發(fā)酵時間1-2天；

步驟c中發(fā)酵罐液體發(fā)酵條件：裝料系數(shù)0.4-0.6、罐壓0.06-0.08Mpa，溫度25-28℃， 0-24h通氣量為1-2vvm、轉(zhuǎn)速為100-120 r/min，24 h后通氣量為1.5-2.5vvm、轉(zhuǎn)速為130-150 r/min，發(fā)酵時間3-3.5天；

步驟d中淺盤固體發(fā)酵方法：在無菌操作臺上，用無菌不銹鋼盤分裝已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基1.5Kg/盤，同時接入步驟c中所得的液體發(fā)酵產(chǎn)物并混勻，然后將接種后固體發(fā)酵培養(yǎng)基置于固體培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過程中通2 L/min無菌空氣，培養(yǎng)溫度25-28℃，濕度控制在85%-95%，在培養(yǎng)過程中每隔2-3天翻動一次培養(yǎng)基，發(fā)酵時間7-10天。

本發(fā)明還提供了一種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：蔗糖10-40 g/L、蛋白胨0.5-2.5 g/L、NaNO₃ 0.5-2.5 g/L、KH₂PO₄ 0.2-1.2 g/L、K₂HPO₄ 0.2-1.2 g/L、MgSO₄?7H₂O 0.25-3g/L、FeSO₄?7H₂O 0.01-0.05 g/L、初始pH 5-8。