[發明專利]一種自發光煙草及轉基因方法

在審

• 申請號: 201710120673.4
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN108522290A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 段康;張晨;趙娟;生承曄;張業勝;王文;董揚
• 申請（專利權）人: 云南納博生物科技有限公司
• 主分類號: A01H5/00
• 分類號: A01H5/00;C12N15/82;A01H4/00;A01H6/82
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

本發明公開了一種自發光煙草及轉基因方法。所述自發光煙草通過發光基因與質粒載體構建發光基因?質體載體表達載體，發光基因?質體載體表達載體通過質體轉基因技術導入到煙草葉片中，煙草葉片通過組織培養得到。所述質粒載體為p?DK6質粒載體，堿基序列如SEQ ID NO.1所示；所述發光基因為LUX基因。本發明采用質體轉基因技術得到自發光煙草，該方法依賴于外源基因與葉綠體基因的同源重組，具有定點整合外源基因并使之穩定遺傳，環境安全性好，基因產物區域化，表達量極高等優點而受到科學家的青睞。

技術領域

本發明屬于轉基因發光植物技術領域，尤其涉及一種自發光煙草及轉基因方法。

背景技術

在生物進化的過程中，形成了自發熒光的藻類，真菌，細菌，昆蟲等物種。但是，自然界中卻鮮有自發熒光的植物。全世界關于發光煙草的研究涉及方方面面，大多發光煙草的專利都是以將某些發光化合物涂在植物表面，或者是對植物培養裝置進行改造，在使植物在黑暗中發出亮光。

基因工程的蓬勃發展，使得科學家對生物的發光機制有了分子層面的研究。科學家通過將發光基因導入植物細胞的染色體中，從而獲得相應發光植株。在自然界，動物、微生物都有能發光的，唯獨只有植物在進化過程中沒有發光這一現象，故發光植物具有很大的觀賞價值，同時，電影《阿凡達》中的熒光植物給人類極大的憧憬和向往，幾年來，人類對熒光植物的好奇心從未減弱，熒光植物的問世也具有極大的商業價值。

申請號為CN201310396243.7的中國專利申請公開了一種發光仙人球。該發光仙人球采用以下方法得到：熒光素酶基因群PCR擴增；熒光素酶基因群與pM-18T載體的構建；基因測序；融合基因轉入大腸桿菌，測序；目的基因與表達載體的連接；特定啟動子與表達載體的構建；融合基因轉入農桿菌；將基因及熒光素的合成前提物一起轉入植物；以及進行轉代篩選穩定發光煙草體。采用農桿菌轉化法將發光基因整合到植物染色體基因中，拷貝數較低，導致轉化率很低，植物發光不明顯，該方法應用到煙草中幾乎得不到發光煙草。

“Autoluminescent Plants(Krichevsky,et al,2010,Plos one)”一文中以Nicotiana tabacum(四倍體煙草)為受體材料，質粒載體由質體特有啟動子Prrn啟動aadA(篩選基因)和LUX操縱子基因，來作為外源基因表達盒，同時選擇rps12-trnV和trnA-trnI兩種同源位點作為對照，獲得的自發光煙草。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種自發光煙草及轉基因方法。本發明能夠定點整合，且拷貝數高，順利得到高表達的自發光煙草；其自發光煙草在沒有外力作用(外加底物或藍紫光激發等)下，能夠自發出裸眼可見的熒光。

本發明第一方面，提供一種自發光煙草，其特征在于，所述自發光煙草通過發光基因與質粒載體構建發光基因-質體載體表達載體，發光基因-質體載體表達載體再通過質體轉基因技術導入到煙草葉片中，煙草葉片通過組織培養得到。

所述質粒載體為p-DK6質粒載體，堿基序列如SEQ ID NO.1所示。所述p-DK6質粒載體的組成部分：啟動子，終止子，篩選抗性基因(aadA)，多克隆位點，葉綠體基因組同源序列(ORF131，16SrRNA)等。質粒載體中的篩選基因aadA和外源基因LUX分別由質體特異啟動子PpsbA和Prrn啟動，組成兩套基因表達盒，在光量子的表達水平來看，采用兩個啟動子分別啟動的效果較高。

所述發光基因為LUX基因，可通過人工合成獲得，發光基因LUX最早發現于海洋發光細菌中，海洋發光細菌是一類在正常的生理條件下能夠發射可見熒光的細菌，這種可見熒光波長在450-490nm之間，在黑暗處肉眼可見。